论文部分内容阅读
目的:1.探讨GLP-1抑制心肌重构的完整机制,完成GLP-1逆转心肌重构的基础机制研究;2.为干预心肌纤维化、防治慢性心力衰竭提供理论依据。方法:1.细胞培养及分组选用大鼠心脏微血管内皮细胞(Rat Heart Microvascular Endothelial Cells,RHMECs),使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基置于37℃恒温培养箱中培养,每2-3天更换培养基,取处于对数生长期细胞进行试验。分组如下:空白对照组,TGF-β1组,GLP-1组,抑制剂组A,抑制剂组B。除对照组外各组均予10ng/ml TGF-β1干预48h,GLP-1组分别予5nmol/ml、10nmol/ml、20nmol/ml GLP-1干预24h,抑制剂组A予20nmol/ml GLP-1+LY194002干预24h,抑制剂组B予20nmol/ml GLP-1+GSK690693干预24h。2.检测对象及方法选择RHMECs骨架蛋白,内皮细胞特异性标志物VE-cadherin,间质细胞特异性标志物α-SMA、SM22α,信号通路关键蛋白PI3k、Akt为检测对象。利用免疫荧光法检测RHMECs骨架蛋白及细胞形态变化,利用q-PCR检测VE-cadherin、α-SMA、SM22α、PI3k、Akt的表达情况。结果:1.GLP-1可以抑制TGF-β1诱导的RHMECs形态改变。用免疫荧光法观察RHMECs细胞形态及骨架蛋白,结果显示与对照组相比,经TGF-β1处理后细胞由紧密排列的铺路石状变为散在的纺锤状,骨架蛋白增殖重构(P<0.05),呈间质细胞样改变;经不同浓度GLP-1干预后RHMECs形态及骨架蛋白改变较TGF-β1组减弱(P<0.05),并表现出药物浓度依赖性,以20nmol/L GLP-1组效果最为明显。提示GLP-1可以抑制由TGF-β1诱导的RHMECs形态及骨架蛋白间质细胞样改变,且抑制作用呈浓度依赖性。2.GLP-1可以抑制TGF-β1诱导的RHMECs特异性标志物表达改变。用q-PCR观察RHMECs特异性标志物表达情况,结果显示与对照组相比,TGF-β1可以诱导RHMECs内皮特异性标志物(VE-cadherin)表达减少(P<0.05),而间质特异性标志物(α-SMA,SM22α)表达增加(P<0.05),经不同浓度GLP-1干预后这种变化较TGF-β1组减弱(P<0.05),且呈药物浓度依赖性,20nmol/L GLP-1组效果最明显。提示GLP-1可以抑制由TGF-β1诱导的RHMECs间质特异性标志物表达改变,且抑制作用呈浓度依赖性。3.GLP-1可以抑制TGF-β1诱导的RHMECs中PI3k和Akt激活。用q-PCR观察RHMECs中PI3k和Akt的表达情况,结果显示与对照组相比TGF-β1可以诱导PI3k和Akt表达增加(P<0.05),予不同浓度GLP-1干预后,这种变化较TGF-β1组减弱(P<0.05),且呈药物浓度依赖性,20nmol/L GLP-1组干预效果最明显。提示GLP-1可以抑制由TGF-β1诱导的RHMECs中PI3k和Akt激活,且抑制作用呈浓度依赖性。4.GLP-1通过PI3k/Akt通路抑制TGF-β1诱导的RHMECs间质转分化。通过对RHMECs形态、骨架蛋白及特异性标志物表达的观察及检测,我们发现GLP-1可以抑制TGF-β1诱导的RHMECs间质转分化,并且与对PI3k和Akt两种通路关键蛋白的作用表现一致。为进一步明确GLP-1抑制内皮间质转分化的作用机制,我们分别加入两种通路关键蛋白的特异性抑制剂LY194002及GSK690693进行干预并利用q-PCR检测三种特异性标志物(VE-cadherin,α-SMA,SM22α)的表达情况。结果显示加入抑制剂后,α-SMA和SM22α的表达量均较GLP-1组增加,但仍低于TGF-β1组(P<0.05),而VE-cadherin的表达量较GLP-1组减少,但仍高于TGF-β1组(P<0.05)。提示GLP-1是通过PI3k/Akt通路抑制TGF-β1诱导的RHMECs间质转分化。结论:GLP-1可以通过PI3k/Akt通路抑制TGF-β1诱导的大鼠心脏微血管内皮细胞间质转分化,从而抑制心肌纤维化。