背景与目的： 染色体组蛋白N端翻译后的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修饰，可影响组蛋白与DNA的亲和性而改变染色质的状态，从而影响转录因子与DNA序列的结合，对基因表达调控具有类似DNA遗传密码的作用。其中组蛋白乙酰化是一由组蛋白乙酰化酶(histoneacetyltransferase,HAT)和组蛋白脱乙酰酶(histonedeacetylase,HDAC)动态调控的可逆过程。目前研究已证实组蛋白低乙酰化所表现的基因转录沉默，与多种肿瘤的发生、发展有密切的关联。这为应用HDAC抑制剂治疗肿瘤奠定了理论基础，已有的研究结果证实其在肿瘤药物治疗中颇具前景。丙戊酸钠(Valproateacidsodium,VPA)，化学名为2-丙基戊酸钠，抗癫痫治疗的常规药物，一直以其低度高效著称，近期研究证实其是组蛋白脱乙酰转移酶(HDACs)的特异性抑制剂，但其抗肿瘤的作用并未受到较多的关注，因此我们将丙戊酸钠作用于肝癌细胞系HepG2，观察应用VPA调节组蛋白乙酰化水平对肝癌细胞生长状态、细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞增殖周期以及侵袭、迁移能力的影响，同时建立肝癌裸鼠种植模型来观察体内试验效果；进一步检测分析了Caspase3、Caspase8、Caspase9活性及蛋白表达，CyclinA、CyclinD1、CyclinE、P21Waf/cipl蛋白及mRNA表达以及MMP-2、MMP-9蛋白表达来探讨了其下游效应机制，同时观察了应用Caspase特异性抑制剂与VPA协同作用对细胞凋亡的影响对VPA调节Caspase的作用进行了验证。 方法： 应用0.75-4.0mmol/L浓度的VPA作用于HepG2细胞24、48、72、96小时干涉组蛋白乙酰化水平，通过观察细胞数量、形态的变化；MTT法分析细胞增殖活力；AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡的改变；PI法分析细胞增殖周期；细胞克隆形成试验观察克隆形成率的变化；肿瘤细胞体外迁移实验和Tanswell小室体外侵袭模型评价HepG2细胞浸润转移能力及通过口饲VPA治疗裸鼠种植性模型肝癌来验证VPA体内、外逆转肝癌细胞恶性表型的作用。间接免疫荧光法定量分析CyclinA、CyclinD1、CyclinE、P21Waf/cipl、Caspase3、Caspase8、Caspase9、MMP-2、MMP-9蛋白蛋白表达丰度；分光光度法检测Caspase3、Caspase8、Caspase9活性；RT-PCR检测分析CyclinA、CyclinD1、CyclinE、P21Waf/ciplmRNA表达来探讨其作用机制。 结果： 应用VPA调节组蛋白乙酰化能明显抑制肿瘤细胞生长，各实验组均可见细胞数量明显减少、细胞大小不一、形态不规则、部分细胞变圆、高倍镜可见细胞核固缩、胞浆减少、胞浆内出现空泡；药物作用24、48、72、96小时后，各药物浓度组均出现了不同的生长抑制且呈逐渐升高趋势，其中0.75mol/L组作用24-96小时，生长抑制率9-30％；4.0mmol/L组生长抑制率则分别达到37-67％不等。与对照组相比均有显著性差异(p均＜0.001)；并且呈时间(r=0.403p=0.033)、剂量(r=0.473p=0.011)依赖趋势。 通过AnnexinV/PI法检测分析细胞凋亡发现，经0.75～4.0mmol/L丙戊酸钠干预24～96小时后，各实验组均出现不同程度的细胞凋亡增加，细胞凋亡率由6.25％-29.5％不等；对照组细胞凋亡率随培养时间的延长略有增加，但经统计分析证实无差异(F=2.01，p=0.091)；分析不同分组细胞凋亡率，试验组与对照组比较差异有显著统计学意义(p＜0.001)。对照组HepG2细胞培养24、48、72、96h后FCM分析细胞周期均可见顺序出现G1、S、M期，各期细胞所占比例未见明显变化，而0.75～4.0mmol/L丙戊酸钠干预实验组则随药物作用时间、药物浓度的增加而出现逐渐升高的G1期阻滞趋势，与对照组比较G1期细胞比例差异具有显著统计学意义(p均＜0.001)；Pearson分析证实各组细胞凋亡率升高、G1期比例变化与VPA作用时间(r=0.689，p=0.000)、剂量(r=0.677，p=0.000)成正相关。 应用VPA干预HepG2细胞生长14d后，对照组细胞克隆大而饱满，数目较多而试验组细胞克隆形成逐渐减少且体较小、细胞数量少，与对照组比较差异具有显著意义(p＜0.001)；细胞体外迁移实验可见VPA干预24小时后，对照组向划痕部位迁移细胞数目较多，而0.75-4.0mmol/LVPA组细胞迁移数目随药物浓度升高而逐渐减少，细胞迁移抑制率由12％递增至70.4％不等，与对照组比较有显著差异(p＜0.001)。TransWell侵袭模型试验证实VPA可明显抑制HepG2细胞侵袭穿膜能力，试验组穿过聚碳酯膜细胞数目明显低于对照组(p＜0.001)。 体内治疗试验结果显示口饲VPA可明显抑制肿瘤生长，治疗28天对照组肿瘤体积均值由0.09cm3逐渐递增到0.62cm3，而试验组28天后肿瘤体积均值为0.28am3，具有显著差异(p＜0.001)；对照组肿瘤重量均值为1.49g，而治疗组肿瘤重量为1.06g，差异显著(t=5.08，p=0.004)；抑瘤率为23.82％。 HepG2细胞经VPA干预48小时后，Caspase3活性1.5mmol/L组升高约61％、3.0mmol/L组升高约113％，与对照组组比较有显著差异(p＜0.001)：Caspase9活性在1.5mmol/L组、3.0mmol/L组升高比例虽然不及Caspase3，但与对照组比较后差异有显著意义(p＜0.001)，Caspase8活性无明显变化(p＞0.05)；经FCM分析发现HepG2细胞中Caspase3、Caspase9蛋白表达被明显上调，其MFI均值在1.5mmol/L组分别为3.67、2.40，在3.0mmol/L组分别为4.23、2.76，与对照组比较均有显著差异(p＜0.001)；Caspase8蛋白变化与对照组比较无统计学意义(p＞0.05)。经Pearson相关分析，Caspase3、Caspase9蛋白表达丰度增加及活性升高与细胞凋亡增加成正相关(r=0.975、0.998、0.999、0.995,p＜0.001)、Caspase8变化与细胞凋亡无相关性(r=0.59、0.243,p=0.095、0.533)。但当VPA与Caspase3、Caspase9抑制剂共同作用后，HepG2细胞凋亡率均较VPA单独干预组显著降低(p＜0.005)；而Caspase8抑制剂Z-IETD-FMK与VPA协同作用组细胞凋亡率与VPA单独作用组比较无明显差异(p＞0.05)：进一步证实VPA对HepG2细胞Caspase3、Caspase9有明显的上调作用，对Caspase8的上调作用不明显。 1.5mmol/L、3.0mmol/LVPA干预HepG2细胞48h后，CyclinA、CyclinD1蛋白表达被明显下调而P21Waf/cipl蛋白表达被明显上调。CyclinA、CyclinD1、P21Waf/cipl蛋白在1.5mmol/LVPA组MFI均值分别为2.05、2.39、2.56；3.0mmol/LVPA组MFI均值为1.81、2.12、3.01，与对照组比较差异均有显著统计学意义(p＜0.001)；CyclinE蛋白表达变化未见明显差异(p＞0.05)；mRNA水平，与对照组比较HepG2细胞CyclinAmRNA、CyclinD1mRNA表达也被下调而P21Waf/ciplmRNA表达被明显上调(p＜0.001)；与蛋白表达趋势相同CyclinEmRNA表达水平与对照组比较未见明显变化(p＞0.05)。 对照组HepG2细胞培养24h后MMP-2、MMP-9蛋白表达MFI分别为2.65和2.97，而在1.5、3.0mmol/L药物作用组，MMP-2蛋白MFI为2.39、2.09，MMP-9蛋白表达为2.43和2.08，与对照组比较均被明显下调(p均＜0.001)，经Pearson相关分析细胞迁移、侵袭能力变化与MMP-2、MMP-9蛋白表达变化之间的关系证实MMP-2、MMP-9蛋白表达下调与细胞迁移、侵袭能力变化密切相关。 结论： ①细胞学试验结果显示应用VPA调节组蛋白乙酰化可明显抑制肝癌细胞生长、抑制细胞克隆形成、诱导细胞凋亡、诱导细胞增殖周期G1期阻滞、抑制肝癌细胞迁移与浸润，具有明显的逆转癌细胞恶性表型的作用。 ②体内治疗试验也证实VPA可显著抑制动物模型肝癌的生长增殖，为以后的实验奠定了基础。 ③应用VPA调节组蛋白乙酰化诱导肝癌细胞凋亡的下游机制主要是通过激活Caspase9介导的细胞色素C凋亡途径，Caspase8介导的死亡受体途径在此过程中并不显著。 ④其诱导癌细胞增殖周期G1期阻滞主要通过上调P21Waf/ciplmRNA及P21Waf/cipl蛋白表达、下调CyclinD1mRNA、CyclinD1蛋白、CyclinAmRNA、CyclinA蛋白表达分别和/或协同实现。 ⑤下调MMP-2、MMP-9蛋白表达可能是VPA抑制肝癌细胞浸润、迁移的主要效应机制之一。