论文部分内容阅读
目的：通过夹脊电针干预ALS-SOD1G93A转基因小鼠,观察其对小鼠疾病进程和行为学的影响,并从拮抗谷氨酸兴奋性毒性为切入点探讨产生该影响的分子机制,为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。方法：第一部分夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠疾病进程和行为学的影响：1ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：本实验以ALS-SOD1G93A转基因小鼠为实验对象,于小鼠日龄30天时,应用美国Jackson实验室提供的引物序列和方案对小鼠进行PCR鉴定,并根据病情进展观察小鼠的表型特征。2.分组及处置：ALS-SOD1G93A转基因小鼠30只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各10只,于小鼠日龄60天开始干预,电针组针刺双侧L1～2、L5-6夹脊穴,躯干同侧2Hz电针治疗；手针组针刺双侧L1-2、L5-6夹脊穴；模型组予以捆绑固定；20min/次,2次／周,共4周。3.神经功能评分及行为学测试：联合应用悬尾试验、称重、转棒实验来观察小鼠发病及疾病进展情况。第二部分夹脊电针拮抗ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓神经元兴奋性毒性的机制研究：1.分组及处置：ALS-SOD1G93A转基因小鼠33只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各11只,同窝野生型小鼠11只作为阴性对照,电针组、手针组、模型组处置同第一部分,阴性对照组不做任何处置。2.HE染色、透射电镜：观察各组小鼠日龄120天时腰髓前角运动神经元形态学变化。3.ELISA法：检测各组小鼠日龄1 20天时血清谷氨酸的含量。4.免疫组化法：检测各组小鼠日龄120天时腰髓前角EAAT2、AMPA受体GluR2亚单位的表达情况。5.免疫印迹法：检测各组小鼠日龄120天时腰髓EAAT2和AMPA受体G1uR2亚单位相对表达量的变化。结果：1.ALS-SOD1G93A转基因小鼠的鉴定：PCR鉴定：出现两个条带的泳道对应的受检小鼠为SOD1-G93A转基因小鼠,仅出现一个条带的泳道对应的受检小鼠为同窝野生型小鼠,阳性率为40%±5%。表型特征：小鼠于日龄90天左右出现悬尾时后肢震颤或伸展无力,100-120天左右出现行动缓慢及后肢拖拽,140-150天左右小鼠完全瘫痪,不能爬行和自主进食,侧卧于垫料上。2.体重分析：与模型组比较,电针能明显延缓小鼠体重丢失,有显著性差异(P<0.05),手针组小鼠体重丢失亦得到一定的延缓,但无统计学意义(P>0.05)。3.发病时间和生存期分析：与模型组比较,电针组小鼠发病推迟了8天,有显著性差异(P<0.05),手针组小鼠发病推迟了5天,但无显著性差异(P>0.05)。与模型组比较,手针组、电针组小鼠生存期分别延长了5天和10天,有显著性差异(P<0.05,P<0.01)；与手针组比较,电针组小鼠生存期延长了5天,有显著性差异(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析可知,小鼠日龄147.6天时,模型组小鼠存活率明显低于手针组和电针组。4.转棒实验分析：与模型组比较,从19周到21周,手针组和电针组小鼠转棒运动功能明显得到改善(P<0.05,P<0.01),且电针组改善更明显(P<0.05,P<0.01)。5.形态学：①HE染色可见模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少,神经细胞结构不清、固缩,胞质胞核染色不清,核固缩,出现空泡状改变；与模型组比较,手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目增多,神经细胞结构形态有所改善,空泡化减少,且电针组效果优于手针组。②运动神经元计数：模型组小鼠腰髓前角运动神经元数目明显减少(P<0.01)；手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元数目较模型组增多(P<0.05,P<0.01),且电针组较手针组增多更明显(P<0.05)。③透射电镜可见模型组小鼠腰髓前角神经细胞萎缩,细胞膜皱缩,线粒体不同程度肿胀,嵴出现断裂、减少,有些线粒体虽可辨认,但已呈空泡状,核膜凹陷变形或部分破裂,异染色质聚集成块,变性的神经细胞周围可见胶质细胞围绕形成卫星现象；与模型组比较,手针组和电针组小鼠腰髓前角神经细胞超微结构有所改善,且电针组改善更明显。6.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠血清谷氨酸含量的影响：ELISA结果显示,模型组小鼠血清中谷氨酸含量显著升高(P<0.01)；与之相比较,手针组和电针组显著降低(P<0.01),且电针组较手针组降低更加明显(P<0.05)。7.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓EAAT2的影响：免疫组化染色结果显示,模型组小鼠腰髓前角EAAT2的表达显著下降(P<0.01)；与之相比较,手针组和电针组EAAT2的表达显著升高(P<0.05,P<0.01),且电针组优于手针组(P<0.05)。免疫印迹结果显示,模型组小鼠腰髓EAAT2蛋白表达下降(P<0.01)；与之相比较,手针组和电针组EAAT2蛋白表达显著升高(P<0.01),且电针组较针刺组升高更明显(P<0.01)。8.夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓AMPA受体GluR2亚单位的影响：免疫组化染色结果显示,模型组小鼠腰髓前角GluR2的表达显著下降(P<0.01)；与之相比较,手针组和电针组G1uR2的表达显著升高(P<0.01),且电针组优于手针组(P<0.05)。免疫印迹结果显示,模型组小鼠腰髓GluR2蛋白表达下降(P<0.01)；与之相比较,手针组和电针组GluR2蛋白表达显著升高(P<0.01),且电针组较手针组升高更加显著(P<0.01)。结论：1.夹脊电针能够改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠的运动功能,延缓发病,延长生存期,其效果优于手针治疗。2.夹脊电针可以改善ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化,其效果优于手针治疗。3.夹脊电针通过上调ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓EAAT2的表达降低神经元微环境中谷氨酸水平,同时通过上调腰髓AMPA受体G1uR2亚单位的表达,提高神经元抗兴奋性毒性能力,其效果优于手针治疗。