铜（Cu）是植物必需的一种微量元素,当植物吸收和积累铜过量时,会对植物产生毒害效应,出现叶绿素含量降低、植株根伸长受抑制、诱导氧化胁迫等,从而影响植物正常生长。甲硫氨酸（Met）作为含硫氨基酸,尤其易被氧化形成甲硫氨酸亚砜（MetSO）,影响细胞正常生命活动。甲硫氨酸亚砜还原酶（Methionine sulfoxide reductases,MSRs）能够特异性地将MetSO还原为Met,恢复蛋白正常活性及功能。MSR在植物细胞中以游离态、蛋白结合态两种形式存在。该家族蛋白可分为A型与B型,MSRA特异性还原S型甲硫氨酸亚砜（Met-S-SO）,MSRB型则特异性还原R型甲硫氨酸亚砜（Met-R-SO）。水稻中发现9个MSRs蛋白,其中MSRA蛋白有5种,MSRB型蛋白有4种。但OsMSR在重金属胁迫下的生理功能目前还并不清楚。本论文利用反向遗传学、点突变、MSR酶蛋白的体内体外分析和酵母双杂交技术,研究了水稻OsMSRA2.1、OsMSRA4.1、OsMSRB3蛋白在应答铜和甲基紫精胁迫过程中的功能。获得如下结果:首先,利用梯度浓度的硫酸铜（CuSO4）与甲基紫精（MV）分别处理野生型水稻（冬津,Dongjin）,实验结果表明,20μM CuSO4与1.0μMMV显著抑制水稻的正常生长,降低水稻叶片光合色素含量,过量Cu处理能显著增加根尖质膜透性。其次,通过瞬时表达,本文分析OsMSRA2.1和OsMSRB3的亚细胞定位。激光共聚焦结果显示,OsMSRA2定位于胞质,而OsMSRB3定位于质体。在已有的osmsra2、osmsrb3和osmsra4的T-DNA插入突变体材料基础上,又通过Crispr/Cas9基因敲除技术成功构建了OsMSRA4.1基因敲除水稻突变体osmsra4。在正常生长条件下,水稻各突变体材料与野生型相比,生长相对缓慢,千粒重较低。铜处理后,突变体水稻根尖质膜受到的损伤、叶片H2O2积累也更为明显,抗氧化酶活性升高。其中osmsra2 T-DNA插入突变体表现出的氧化损伤最为明显,osmsra2、osmsrb3 T-DNA插入突变体根尖铜积累量明显高于野生型。水稻叶片总MSR活性测定结果显示,突变体株系中MSR活性较野生型稍低,其中osmsrb3内MSR对Met-R-SO的还原活性低于其他株系,这可能与MSRB特异性还原R型甲硫氨酸亚砜（Met-R-SO）有关。另外,为了明确MSR蛋白中半胱氨酸（Cys）活性位点对自身蛋白抗氧化能力的影响,本文对OsMSRB3蛋白氨基酸序列中第159和212位的活性位点Cys对应的碱基进行替换,并对OsMSRB3及其活性位点突变蛋白（OsMSRB3C159,C212）进行原核表达。在大肠杆菌耐性实验中,1.0 mM Cu胁迫下,表达OsMSRB3活性位点突变蛋白的大肠杆菌其生长活性高于阴性对照组,但低于未突变OsMSRB3蛋白的大肠杆菌。该结果验证了 OsMSRB3 Cys的活性位点作用;该结果同时也说明,OsMSRB3发挥抗氧化胁迫功能时除了依靠Cys活性位点的作用,可能还存有其他方式发挥蛋白作用。最后,为进一步探究Cu胁迫下OsMSR的作用机制,本实验通过酵母双杂技术,从细胞质蛋白文库中筛选到OsMSRA2.1的互作蛋白OsMYBAS1-3;亚细胞定位结果显示OsMYBAS1-3定位于细胞核中,该结果与其转录因子的特点吻合;同时,Cu或MV处理能够上调野生型水稻中OsMYBAS1-3转录水平的表达。关于该蛋白功能以及与OsMSRA2间的互作机制,有待后续的实验验证。