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现代研究表明神经细胞保护是防治神经退行性疾病,如老年性痴呆、重症抑郁症、帕金森症和中风等疾病的重要机制。豆科木豆属植物木豆[Cajanus cajan (L.) Millsp.]的叶子作为传统药物在民间被广泛使用,近年来发现其提取物具有抗Aβ25-35诱导小鼠学习记障碍及对海马神经细胞损伤具有保护活性。但是,其神经细胞保护的活性成分和作用机制并不清楚。本文将在活性指导下,对木豆叶神经细胞保护活性成分进行分离,并对活性强的化合物进行深入的机制研究。首先,制备了木豆叶醇提取物的不同部位,并进行抗皮质酮诱导PC12细胞损伤的活性筛选,结果发现发现的四个部位均在不同程度上表现出抗皮质酮诱导损伤的神经保护活性,但脂溶性部分在较低浓度时即表现较强的活性,提示着木豆叶醇提取在低极性部分具有较强的活性化合物。随后,利用各种分离色谱技术及光谱技术从木豆叶活性部位中分离并鉴定23个化合物,其中黄酮类化合物9个、茋类化合物4个和其他化合物10个。它们结构分别是木豆素(Cajaninstilbene acid)、木豆素A (Longistylin A)、木豆素C (Longistylin C)、木豆内酯A(Cajanolactone A)、球松素(Pinostrobin)、荭草苷(Orientin)、异牡荆苷(Isovitexin)、牡荆苷(Vitexin)、 Cajanol、Cajanin、樱黄素(Prunetin)、红车轴草素(Pratensein)、(2R,3R)-2,3-二氢-5-7,4’-二甲氧基黄酮(2R,3R-2,3-dihydro-5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavone)、10’,16’-二羟基棕榈酸乙酯(Ethyl 10’,16’-dihydroxy hexadecanoate)、香草酸(Vanillic acid)、十七烷酸乙酯(Ethyl heptadecanoate)、2-O-甲基肌醇(2-Oquebrachitol)、2,3,4-三羟基异戊酸(2,3,4-trihydroxy-isovaleric acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、桦木酸(Betulinic acid)、十七烷酸(Heptadecanoic acid)、β-谷甾醇(β-sitosterol)和β-胡萝卜苷(p-daucosterol)。为了进一步明确木豆叶中化学成分,运用UPLC-QTof-MS技术对木豆叶乙醇提取物定性分析,鉴定出18个化合物,黄酮类14个,茋类4个。4个茋类化合物均分离得到,有8个黄酮类化合物是未分离得到,它们的结构是：槲皮苷(Quercitrin)、刺苞菊甙(Carlinoside)、异槲皮苷(Tsoquercitrin)、芦丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、芹黄素(Apigenin)和Cajaflavanone。从UPLC-QTof-MS分析结果表明,茋类和黄酮类成分是木豆叶中的主要成分,茋类化合物主要苷元存在,未发现糖苷；黄酮类化合物苷元和苷均有发现。在完成化合物分离的基础上,建立PC12细胞的皮质酮损伤、谷氨酸损伤和过氧化氢损伤三个模型,对8个主要化合物(四个黄酮化合物：牡荆苷、荭草苷、球松素、Cajanol;四个茋类化合物：木豆素、木豆素A、木豆素C和木豆内酯A)进行细胞保护活性筛选,结果表明8个化合物均在不同程度上具有一定的神经细胞保护活性,但是茋类体现出较强的保护活性。木豆素和木豆素C分别对皮质酮和谷氨酸诱导的PC12细胞损伤具有较强的保护活性。为了探讨木豆茋的神经细胞保护活性与其抗氧化之间的关系,本文采用体外抗氧化评价法(化学评价和细胞学评价)对茋类化合物的抗氧化活性进行测定。化学评价表明木豆素具有较强的自由基清除活性,而木豆素A具有较强的还原活性。细胞学评价表明四个茋类化合物具有不同程度的抗氧化活性,木豆素能够最大程度地降低细胞内ROS和MDA的含量,增加细胞中SOD和CAT的活性,木豆素A次之。该实验表明木豆茋抗氧化的化学评价和生物学评价具有一定的相关性。为了阐明木豆茋神经损伤保护的可能机制,本文选择木豆素和木豆素C分别进行抗皮质酮和抗谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的机制研究。通过MTT(甲基噻唑基四唑)法、LDH释放、Hoechst 33342染色法和流式细胞凋亡检测等药效学方法,证明Longistylin C具有显著的抗谷氨酸神经细胞保护的活性。作用机理表明,Longistylin C能够明显下调由高浓度谷氨酸过度激活的天门冬氨酸受体(NMDAR/NR2B)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII),上调磷酸化细胞外信号调控激酶1和2(p-ERK1/2)、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)。降低细胞内的钙离子浓度和ROS浓度、下调内质网伴侣分子糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP/GADD153)、细胞核转录因子X盒结合蛋白抗体(XBP-1)、Caspase-12和Caspase-9,从而缓解由谷氨酸兴奋性毒性诱导的氧化应激和内质网应激。同时,通过逆转线粒体膜通透性转运孑L(MPTP)的异常开放和线粒体膜电位(MMP)的去极化,下调细胞胞质中的细胞色素C、Caspase-3和ICAD,在一定程度上恢复线粒体的功能,从而抗谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡。通过MTT法、LDH释放、Hoechst 33342-PI双染法和流式细胞凋亡检测等药效学方法,证明CSA具有显著的抗皮质酮神经细胞保护活性。机制研究表明,CSA能够作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC-6)的抑制剂,下调细胞中过多的HDAC-6表达,从而导致热休克蛋白90(HSP90)乙酰化后,脱离其辅酶因子,与糖皮质激素受体(GR)的亲和力降低,从而间接下调GR表达。另一方面发现,CSA具有雌激素样作用,能够与雌激素受体(ER)结合而激活MAPK通路,通过上调磷酸化分裂原活化抑制剂(p-MEK)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERKl/2)和磷酸化反应元件结合蛋白(p-CREB)参与调节神经元和突触的可塑性;同时上调磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)、磷酸化促凋亡蛋白(p-Bad)而激活线粒体抗凋亡途径。此外,通过降低细胞内的钙离子浓度,而缓解凋亡通路下游的氧化应激和内质网应激。本文通过神经细胞保护活性指导下的化学分离、活性筛选及机制的研究,发现木豆叶醇提物中的神经保护活性化合物主要是木豆茋类；其作用机制主要通过抑制下游的氧化应激、内质网应激、恢复线粒体功能,以及调节上游受体靶点,达到抗细胞凋亡。此外,本论文还对神经细胞的主要凋亡机制和损伤模型及木豆叶化学成分和药理活性研究进展进行了综述。本文研究为寻找神经细胞保护的活性化合物或先导化合物提供了科学的依据,亦为木豆叶开发神经退行性疾病的防治药物提供了参考。