荜茇酰胺提取分离及抗乳腺癌的作用机制

来源 :陕西科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yanmu1984
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乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,造成了沉重的医疗负担和社会负担。乳腺癌的治疗方案包括手术、放射治疗、内分泌治疗、靶向治疗以及化学治疗。目前,化疗仍是乳腺癌临床治疗的主要方案,但其毒副作用较大、易导致耐药的问题一直缺乏改善,导致预后很差。因此,寻找新的药物与其联用从而改善这些问题就显得尤为紧迫。荜茇酰胺(piperlongumine,PL)被报道具有选择性的抗癌活性,但其在国产荜茇根中的分布,以及单用和联用时杀伤乳腺癌的机制仍有待深入调查。本论文依次研究了荜茇酰胺的提取分离、荜茇酰胺单用以及与胡椒碱、阿霉素联用的抗癌作用和机制。第一,研究了国产荜茇根中的生物碱成分。4.5 kg荜茇根购自云南并经形态学鉴定,粉碎后经乙醇提取和减压浓缩,得到470 g浸膏。溶解浸膏,用硅胶柱色谱分离,以石油醚、乙酸乙酯、甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱,得到3相提取物,其中石油醚相24g,乙酸乙酯相203 g,甲醇相232g。各相使用不同比例的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱并逐相分离,共得到15种成分。通过碘化铋钾显色反应确定其中4种成分为生物碱类化合物。通过核磁解析确定4种生物碱分别为荜苃酰胺(12.8 mg)、胡椒碱(piperine,PP)(8.59 g)、胡椒内酰胺A(70.4mg)、胡椒内酰胺D(20.4mg)。上述结果表明,国产荜茇根含有丰富的生物碱,其中荜茇酰胺和胡椒碱为抗癌活性成分。第二,研究了荜茇酰胺在体外和体内抗乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验显示,荜茇酰胺能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7增殖并诱导其凋亡,而对正常乳腺细胞MCF-10A的作用较弱,表现出一定抗癌选择性。蛋白免疫印迹实验显示,荜茇酰胺能有效抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞中信号转导与转录激活子 3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的活化,从而调控STAT3下游不同信号通路分子的表达,最终诱导细胞凋亡,并且这种调控作用依赖于活性氧(reactive oxygen species,ROS)。裸鼠造模实验显示,4mg/kg和12mg/kg荜茇酰胺均能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量,并下调肿瘤组织中p-STAT3表达,但高剂量组的抑癌作用并未显著强于低剂量组。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色实验显示,荜苃酰胺在相应剂量下对裸鼠均无显著的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺可有效抑制乳腺癌细胞增殖,并具有良好的选择性和体内安全性。第三,研究了荜茇酰胺和胡椒碱联合应用抗乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱均能抑制乳腺癌细胞增殖,荜茇酰胺的活性显著强于胡椒碱,且表现出一定抗癌选择性,细胞凋亡实验证实了这一结论。联合指数(combination index,CI)分析实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱在中低剂量联用时(PP 50 μM+PL 5 μM、PP 100μM+PL 5μM)在 MDA-MB-231、MCF-7细胞中的CI值均小于1,而在MCF-10A细胞中则大于1,表明两药在该剂量下对乳腺癌细胞具有选择性的协同抑制作用,两药联合的细胞凋亡实验证实了这一结论。蛋白免疫印迹实验显示,当两药单用时,荜茇酰胺可抑制MDA-MB-231细胞中p-STAT3表达,而胡椒碱则上调了 p-STAT3表达。当两药联用时,p-STAT3表达显著下降,表明荜茇酰胺和胡椒碱产生了协同抑制STAT3活化的作用,这种协同调控作用并未发生在正常乳腺细胞中。裸鼠造模实验显示,4mg/kg荜茇酰胺和10mg/kg胡椒碱联用时能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量,并协同抑制肿瘤组织中p-STAT3表达。HE染色实验显示,荜茇酰胺和胡椒碱在相应剂量下对裸鼠均无显著的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺和胡椒碱可协同抑制乳腺癌细胞增殖,并具有良好的选择性和体内安全性。第四,研究了荜茇酰胺和阿霉素(doxorubicin,DOX)联合应用抗三阴性乳腺癌的作用和机制。细胞增殖实验显示,荜茇酰胺和阿霉素均能抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,阿霉素的活性显著强于荜茇酰胺,细胞凋亡实验证实了这一结论。CI分析实验显示,荜茇酰胺和阿霉素在低剂量联用时(PL 5μM+DOX 0.5μM)在 MDA-MB-231、MDA-MB-453 细胞中的 CI 值分别为0.57和0.61,表明两药在该剂量下对三阴性乳腺癌细胞具有良好的协同抑制作用,两药联合的细胞凋亡实验证实了这一结论。蛋白免疫印迹实验显示,当两药单用时,荜茇酰胺可抑制两种细胞中p-STAT3表达,而阿霉素则显著上调了 p-STAT3表达。相较于阿霉素单用,两药联用时抑制了 p-STAT3表达,即荜茇酰胺可逆转阿霉素活化STAT3的不利调控作用。裸鼠造模实验显示,4 mg/kg荜茇酰胺和0.8 mg/kg阿霉素联用时能够有效降低裸鼠肿瘤体积和重量。此外,荜茇酰胺可逆转肿瘤组织中阿霉素上调p-STAT3的不利调控作用。HE染色实验显示,荜茇酰胺和阿霉素在相应剂量下对裸鼠均无显著的器官毒性。上述结果表明,荜茇酰胺和阿霉素可协同抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,并具有良好的体内安全性。综上所述,本论文从国产荜茇根中分离出荜茇酰胺;揭示了荜茇酰胺通过氧化应激效应抑制STAT3活化进而介导三条信号途径诱导乳腺癌细胞凋亡的机制;论证了荜茇酰胺和胡椒碱、阿霉素协同抗乳腺癌的作用和机制。本论文的研究表明,荜茇酰胺抑制STAT3活化的作用将有助于降低阿霉素的毒副作用并改善其耐药问题,为乳腺癌的临床治疗提供了新的思路。
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