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研究背景炎症、创伤、肿瘤等原因造成的骨缺损是当今人类社会的一大健康挑战。实现高效稳定的骨组织再生是亟待被满足的一大临床需求。通过支架、种子细胞及生物活性因子的协同作用,骨组织工程为实现理想的骨修复提供了新的契机。水凝胶是一种和细胞外基质结构和性质相似的高度含水的三维网络仿生材料,被广泛用作组织工程支架及药物递送载体。在生物医学应用中根据其用途不同,水凝胶不断被改性、修饰,以获得更具优势的性能。其中四臂聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）水凝胶制备简便、网络结构高度规则、机械强度极高,具有良好的生物应用前景。壳聚糖（chitosan,CS）是一种广泛存在于自然界的碱性多糖大分子,拥有极佳的生物相容性、抗炎、促进细胞粘附等诸多优势。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）是一种成体牙源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,具有较强的增殖、成骨向分化和免疫调节能力,是牙周组织及骨组织再生中理想的种子细胞。大量研究发现阿司匹林对于MSCs的体外成骨向分化及其介导的体内成骨有明确促进作用,可以作为一种生物活性因子应用于骨组织工程中。构建具有活性因子缓释作用、兼具良好生物相容性、良好机械性能的支架有利于促进骨缺损区域的骨再生,目前加载PDLSCs并实现阿司匹林缓释的骨组织工程支架尚未见研究报道。研究目的本研究旨在采用经济便捷的合成策略构建体内外生物相容性优良的基于四臂PEG水凝胶的骨组织工程支架,通过物理包埋及引入CS与阿司匹林的静电相互作用实现适宜的阿司匹林缓释动力学。该支架需能够有效加载及促进种子细胞的生物功能、调控宿主MSCs行为及局部免疫微环境,以达到理想的骨组织再生效果,为今后骨组织工程支架的设计和临床应用提供参考。研究方法1.四臂聚乙二醇水凝胶阿司匹林缓释支架的体内外成骨作用从拔除的健康正畸减数牙牙周膜分离提取原代PDLSCs并鉴定、培养。采用一系列含浓度梯度阿司匹林的成骨诱导培养基体外诱导PDLSCs成骨向分化,在诱导7天和14天进行RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色及半定量分析,得出促进PDLSCs体外成骨的最佳浓度。通过活性酯-氨基缩合反应与阿司匹林的物理包埋合成四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架并观察四臂PEG水凝胶支架表面形貌及加载至材料表面PDLSCs的细胞形态,测定载药四臂PEG水凝胶支架阿司匹林的缓释曲线。通过一系列体外细胞毒性实验研究四臂PEG阿司匹林缓释支架的体外生物相容性。通过RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色及半定量分析得出四臂PEG阿司匹林缓释支架对PDLSCs体外成骨分化能力的影响。将水凝胶支架植入裸鼠皮下取材观察材料体内降解情况、埋植区大体观状态,进行组织学染色,观察局部组织的炎症状态。最后,将四臂PEG水凝胶支架加载PDLSCs后植入小鼠颅顶骨缺损内,8周后取材进行micro-CT扫描计算新生骨面积占比。样本脱钙后制备组织切片,进行组织学染色,观察骨缺损区新生骨及纤维结缔组织的形态结构,并进行干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）免疫荧光染色评估载药与空载四臂PEG水凝胶支架植入后对骨缺损周边免疫微环境的影响。2.四臂聚乙二醇-壳聚糖复合水凝胶阿司匹林缓释支架的构建及对牙周膜干细胞介导的骨组织再生的作用评价采用活性酯-氨基缩合反应、四臂PEG与CS的氢键和分子缠结等相互作用药物物理包埋及支架-药物静电作用缓释策略合成四臂PEG-CS水凝胶阿司匹林缓释支架。通过傅里叶变换红外光谱获得复合凝胶支架的红外光谱、分析内部化学基团及组分间的相互作用。观察支架表面形貌、所加载细胞的形态并测量孔隙尺寸。通过乙醇替代法测试载药与空载四臂PEG-CS复合凝胶的孔隙度,PBS浸泡法测试溶胀曲线、体外降解曲线及四臂PEG-CS复合凝胶阿司匹林缓释支架的药物缓释行为。材料的生物相容性及对PDLSCs成骨分化的影响通过体外实验测定。最后,将加载不同植入小鼠颅顶骨缺损内,8周后取材进行micro-CT扫描计算新生骨面积占比及骨体积分数。组织切片进行染色,观察骨缺损区新生骨及纤维结缔组织的形态结构。研究结果1.四臂聚乙二醇水凝胶阿司匹林缓释支架的体内外成骨作用（1）阿司匹林对PDLSCs成骨向分化作用具有浓度依赖性,在100μg/ml时阿司匹林产生最强的成骨促进作用;（2）载药的四臂PEG水凝胶能够持续释放阿司匹林超14天;（3）体外细胞毒性实验证实四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架对细胞活性及增殖能力无负面影响,且有效促进了体外PDLSCs介导的成骨作用;（4）与加载PDLSCs未载药的水凝胶支架相比,加载PDLSCs的载药水凝胶支架在骨缺损原位获得了更多的新生骨修复;（5）四臂聚乙二醇水凝胶阿司匹林缓释支架能够有效降低植入周边皮肤炎性细胞浸润情况,降低骨缺损部位IFN-γ水平。2.四臂聚乙二醇-壳聚糖复合水凝胶阿司匹林缓释支架的构建及对牙周膜干细胞介导的骨组织再生的作用评价（1）相比于研究一中的四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架,四臂PEG-CS水凝胶阿司匹林缓释支架有着更平缓的药物释放曲线;（2）四臂PEG-CS复合凝胶阿司匹林缓释支架生物相容性良好。与载药的四臂PEG水凝胶相比,载药四臂PEG-CS水凝胶促进PDLSCs的体外成骨向分化作用更加显著;（3）与仅加载PDLSCs、仅加载阿司匹林及空载复合凝胶支架相比,加载PDLSCs的四臂PEG-CS复合凝胶阿司匹林缓释支架骨缺损修复能力更强。与加载PDLSCs的四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架相比,加载PDLSCs的四臂PEG-CS复合凝胶阿司匹林缓释支架在体内外成骨方面更具优势。结论1.四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架无毒、可充分降解、生物相容性较好,具有一定的细胞粘附能力,阿司匹林缓释能力较好。加载PDLSCs后可获得较好的体内成骨效果,其促进成骨的机制可能是通过改善骨免疫微环境实现;2.通过CS对四臂PEG水凝胶进行改性,四臂PEG-CS复合凝胶阿司匹林缓释支架除拥有合适的理化特性、优秀的生物相容性及良好的细胞粘附性,与四臂PEG水凝胶阿司匹林缓释支架相比实现了更平缓的药物释放曲线,对PDLSCs介导的骨组织再生起到了更强的促进作用。