厌氧海藻酸分解菌的筛选及其海藻酸裂解酶研究

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海藻酸是一种广泛存在于褐藻细胞壁中的无支链的多糖,是重要的海洋生物质资源。海藻酸分解菌是能够合成海藻酸裂解酶的一类细菌,是海藻酸裂解酶的重要来源。海藻酸裂解酶在食品工业、农业、医学和生物能源领域有着巨大的潜在应用前景,因此,筛选新型海藻酸分解菌并研究其海藻酸裂解酶特性具有重要的应用价值。本研究从广东省汕头市汕头港采得海洋沉积物样品,分离获得一株厌氧海藻酸分解细菌SH-52。根据形态学特征、细菌脂肪酸、理生化特征、(G+C)mol%、16SrRNA序列系统进化分析等指标对菌株进行了鉴定。菌株SH-52为杆状,革兰氏阴性,厌氧菌;该菌可以在20℃-45℃的温度范围内生长,其中最适生长温度为30℃。可以在pH6.0-8.5的范围内生长,最适pH为7.5。可以耐受1%-9%浓度的NaCl,最适NaCl浓度为3%。菌株可以将硫和硫代硫酸钠中的硫还原为H2S。细菌基因组的(G+C)mol%为44%。细胞主要的脂肪酸为C15:0iso,C17:1w6c, C15:1w6c, C15:0anteiso, C16:0和C17:0。通过系统进化分析发现,与分离菌株SH-52亲缘关系最接近的是Sunxiuqinia elliptica DQHS-47,但16S rRNA基因序列的相似度只有93%并且SH-52菌株在细胞形态、需氧性和底物利用等方面与Sunxiuqinia elliptica DQHS-4具有显著地差异。因此本研究建议菌株SH-52为一个新属新种,并命名为Marinicatena alginatilytica。本研究还确定了SH-52菌株的最优产酶条件,最优的发酵条件为35℃,培养基pH8。优化的碳源、氮源和金属离子浓度为:0.5%(W/V) Alginate,0.32%(W/V) Yeast extract,2%(W/V) NaCl,0.01%(W/V) CaCl2。优化的产酶培养基可以使细菌产酶峰值提前12小时,最大酶活达到16U/ml,比优化前高2倍。利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析的方法纯化了分离菌株SH-52的海藻酸裂解酶,获得三种海藻酸裂解酶:SHA-1、SHA-2和SHA-3。其中对SHA-1的纯化最后得到了0.84mg的蛋白,酶活回收了108U,回收率为6.2%,比酶活力达到了128.5U/mg,比细胞裂解液高27.8倍。对SHA-2的纯化得到了1.21mg的蛋白,酶活回收了119.7U,回收率为6.8%,比酶活力达到了98.34U/mg,比细胞裂解液高22倍。对SHA-3的纯化得到了0.43mg的蛋白,酶活回收了197U,回收率为5.9%,比酶活力达到了458U/mg,比细胞裂解液高32.2倍。利用SDS-PAGE检测蛋白分子量,SHA-1的分子量约为60.2KDa, SHA-2的分子量约为42.9KDa, SHA-3的分子量约为51.3KDa。进一步对纯化的海藻酸裂解酶SHA-1、SHA-2和SHA-3的温度、pH值、金属离子的影响、底物特异性和剪切类型等特性进行了研究。研究发现SHA-1是一种外切polyM特异性的海藻酸裂解酶,其最适反应温度为50℃,最适pH为8.5,可以在50℃以下保持稳定。SHA-2是一种内切polyG特异性的海藻酸裂解酶,最适反应温度为40℃,最适pH在6-6.5之间,可以在45℃以下保持稳定。SHA-3是一种外切polyG特异性的海藻酸裂解酶,最适反应温度为40℃,最适pH在6.5-7之间,可以在50℃以下保持稳定。
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