口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease virus, FMDV）引起的一种严重危害偶蹄动物的高度接触性、热性、急性传染病。FMDV有7个血清型及70多个不同亚型，这使对口蹄疫的疫苗防控存在着诸多的困难，这就要求我们探索抗口蹄疫病毒的新方法与新途径。随着生物技术的迅猛发展，利用RNA干扰和转基因技术来培育具有抗口蹄疫病毒的转基因动物成为可能。鉴于此，本研究将RNA干扰和转基因克隆技术相结合，获得靶向O型口蹄疫病毒的转基因克隆猪育种新材料，为下一步转基因猪新品种培育和产业化奠定基础。我们根据GenBank中的O型口蹄疫病毒基因组序列，选择VP1和3D基因中的保守区段，选取一段21nt长的核酸序列，结合siRNA序列的设计原则设计单链DNA，由公司人工合成后，将其退火、合成双链后与载体RNAi-ReadypSIREN-Retro Q-ZsGreen混合连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌落，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将鉴定正确的表达载体大剂量提取质粒，按照Lipofectamine2000Reagent试剂说明书操作步骤，将提取的质粒转染到不同实验组的BHK-21细胞中。转染48h后，取用Reed-Muench公式及原理测过TCID50的原病毒液，以2×103TCID50/孔感染转染后的细胞，在接毒后不同时间点观察CPE情况，初步判定转染表达质粒组和阴性对照组CPE是否有差异。提取不同时间点细胞毒液的RNA，用反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。以克隆正确的VP1、3D质粒为模板，绘制目标基因和β-actin内参基因标准曲线。目标基因和内参基因样品各做三次重复，通过一系列的计算过程得出样品表达量，分析计算结果，筛选出抑制口蹄疫病毒复制能力强的干扰片段，然后将高效干扰片段连接到PXL-EGFP-NEO载体上。分离猪胎儿成纤维细胞时先去除胚胎包膜、胎儿内脏、头、尾、脊柱、四肢及骨头，剩下的部分剪成1mm3大小的组织块后加入消化液消化，在饱和湿度、39℃、5%CO2培养箱中消化充分，然后室温离心去除消化液，加入含有20%胎牛血清培养液继续培养，等细胞铺满培养板90%时收集细胞，一部分细胞冻存备用。含有高效干扰片段的载体扩大培养后，大剂量提取质粒，用ApaLI酶切线性化，并用乙醇沉淀，然后将其转染到猪胎儿成纤维细胞中。转染48h后用350μg/mL的G418抗生素筛选阳性克隆，筛选出的阳性克隆培养9d成熟后一部分用于鉴定，一部分冻存作为供体细胞使用。从本市屠宰场收集母猪卵巢，用20mL注射器抽吸卵巢上的卵泡。然后将卵母细胞在洗卵液中洗3次，再在成熟培养液中洗3次，然后放在饱和湿度、38.5℃、5％CO2培养箱中成熟培养。卵母细胞成熟后，在显微操作仪下先用盲吸法将卵母细胞去核，再用注核针吸取阳性猪胎儿成纤维细胞，将其注到卵周隙的透明带下，经电融合后放培养箱中培养。卵母细胞培养成功后，选择合适的发情母猪，经麻醉、绑定等术前处理后暴露手术部位，打开腹腔找到卵巢，将重构胚胎吹入输卵管内，暴露的内脏及手术部位敷上抗生素后缝合腹腔，术后将手术母猪隔离,并连续6d使用抗生素消炎并做好受孕观察。取转基因克隆仔猪的尾组织，分离成纤维细胞，细胞传代培养后观察转基因克隆仔猪的成纤维细胞是否带有绿色荧光。以出生的转基因克隆仔猪耳组织基因组DNA为模板进行PCR及目的条带测序，鉴定仔猪基因组DNA中是否有402bp的目的条带。对分离的成纤维细胞攻毒，攻毒后提取攻毒细胞的RNA并反转录为cDNA，然后做Real-time PCR，鉴定转基因克隆仔猪成纤维细胞是否具有抑制口蹄疫病毒复制的能力。本试验针对O型口蹄疫病毒VP1和3D基因共设计了16对shRNA,退火合成双链siRNA16对，共构建干扰载体16个，经测序16个干扰载体正确。用Reed-Muench公式计算出原病毒的TCID50结果是0.1mL10-3.95稀释的病毒液，即将原病毒稀释8913倍后取0.1mL等于1个TCID50。干扰载体成功的转染了BHK-21细胞，提取攻毒后细胞的RNA，并反转录为cDNA。建立目标基因和β-actin内参基因的标准曲线相关系数为0.998，线性关系好，准确性较高，通过计算pSiRe-Zs-VP1-3和pSiRe-Zs-3D-6两个表达质粒抑制口蹄疫病毒复制效率最好，分别为96.8%和87%。两个高效干扰片段连接到PXL-EGFP-NEO上而构建的PXL-EGFP-NEO-VP1-3和PXL-EGFP-NEO-3D-6两个载体检测结果正确。用酶消化法成功分离了34d猪胎儿的成纤维细胞，而且把线性化的PXL-EGFP-NEO-VP1-3、PXL-EGFP-NEO-3D-6质粒转染到猪胎儿成纤维细胞中，并形成阳性克隆，经PCR检测，阳性细胞中含有目的基因片段。成功培养了猪卵母细胞，并构建了含有抗口蹄疫病毒复制干扰片段的重构胚胎。共做胚胎移植受体母猪54头，经114d受体母猪自然分娩，最后共出生12头转基因克隆仔猪。观察12头转基因克隆仔猪的尾部成纤维细胞，有5头转基因克隆仔猪的成纤维细胞带有绿色荧光，以12头转基因克隆仔猪耳组织基因组DNA为模板，做PCR并分析目的条带，有5头仔猪基因组DNA中带有402bp的目的条带，对成纤维细胞攻毒后做Real-time PCR，有5头转基因克隆仔猪成纤维细胞具有抑制口蹄疫病毒复制的能力。我们成功的获得了抗O型口蹄疫病毒复制的转基因克隆猪，在细胞水平上它对口蹄疫病毒有一定的抑制作用，这为抗口蹄疫病毒抗病育种材料的获得奠定了科学基础。