论文部分内容阅读
第一章CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在不同妊娠时期中的变化目的：通过研究不同妊娠时期母体外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)含量及Foxp3 mRNA表达水平变化规律,探讨CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在妊娠维持中的作用。方法：选择2009年8月-2010年6月在中南大学湘雅三医院产科门诊定期产检的孕妇共60例(早孕组20例,中孕组20例,晚孕组20例)和同期于我院门诊体检的正常未孕妇女20例。收集每位受试对象抗凝外周血10ml,分离外周血中单个核细胞。采用流式细胞术检测单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,半定量RT-PCR检测单个核细胞中Foxp3 mRNA表达。结果：1早、中、晚孕孕妇外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例分别为6.39(6.04-8.33)%、7.90(6.18-9.30)%和7.46(6.59-7.94)%,正常未孕对照组为3.08(2.66-3.30)%。早孕妇女外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞较未孕妇女显著升高(P<0.01)。随着妊娠进展,CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量上升,至中孕期达高峰,晚孕期较中孕期稍低,但三组间无统计学差异(P>0.05)2早、中、晚孕组孕妇外周血中Foxp3 mRNA相对表达水平均显著高于正常未孕组,分别为[(0.564±0.138)、(0.649±0.126)、(0.602±0.088) vs (0.307±0.052)](P均<0.01),但早、中、晚孕组三组间比较无统计学差异(P>0.05)。我们发现外周血Foxp3 mRNA表达水平变化与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量变化规律一致,即妊娠后外周血Foxp3 mRNA表达水平、CD4+CD25+ Foxp3+Treg细胞含量较未孕者显著增高(P<0.01),至中孕期达高峰,晚孕期较中孕期稍低(P>0.05)。结论：1.妊娠期外周血Foxp3 mRNA表达水平变化与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量变化规律一致,提示Foxp3是检测Treg细胞的指标。2.妊娠后母体外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞含量较未孕者显著升高提示Treg细胞在正常妊娠维持中起重要作用。第二章CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在早产、足月妊娠分娩发动后的变化目的：通过研究早产及足月妊娠分娩发动后母体外周血中CD4+CD25+ Foxp3+Treg细胞含量及Foxp3 mRNA表达水平变化规律、蜕膜组织Foxp3 mRNA及蛋白表达水平变化规律,探讨CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞在早产及足月妊娠分娩发动中的作用。方法：选择2009年8月-2010年6月在中南大学湘雅三医院产科住院病例及同期在中南大学湘雅三医院产科门诊定期产检的正常孕妇,共99例：分足月组共48例(其中足月未临产组20例,足月临产组28例)；孕满28周至不足37周组共51例(其中先兆早产组16例；早产临产15例；正常孕妇20例)。收集每位受试对象抗凝外周血10ml；足月和早产产妇胎盘娩出后立即剪取胎盘边缘胎膜组织约10g,将壁蜕膜从平滑绒毛膜上剥离采集；早产产妇取胎盘中心一块1cm×1cm大小胎盘全层组织(包括羊膜层到底蜕膜层)。分离外周血单个核细胞,流式细胞术检测单个核细胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,半定量RT-PCR法检测单个核细胞及蜕膜组织中Foxp3 mRNA表达水平,Western Blot检测蜕膜组织Foxp蛋白表达水平,并通过早产产妇胎盘HE染色,观察早产患者中组织学绒毛膜羊膜炎分布情况。结果：1.足月未临产组与临产组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比分别为7.46(6.59-7.94)%、3.52(2.98-4.16)%,可见足月临产后母体外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞较临产前下降,有显著统计学差异(P<0.01)。2.足月临产后母体外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平较临产前明显下降,有显著统计学差异[(0.312±0.050) vs (0.602±0.088),(P<0.01)]。3.足月临产前、后蜕膜组织Foxp3 mRNA及蛋白表达水平相比均有显著统计学差异[(0.556±0.090)vs(0.249±0.085).(0.579±0.093)vs (0.280±0.078)](P均<0.01)4.先兆早产16例中有6例早产,早产临产组15例均发生早产,即早产患者共21例,其中16例(76%)胎盘病检有组织学绒毛膜羊膜炎。5.先兆早产组、早产临产组与正常妊娠对照组外周血CD4+CD25+ Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞百分比分别为5.27(3.82-7.44)%、1.63(1.09-2.73)%和7.38(6.90-8.78)%,可见早产临产组较先兆早产组母体外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著下降(P<0.01),而先兆早产组Treg细胞含量较正常妊娠对照组也下降,有显著统计学差异(P<0.01)。早产有组织学绒毛膜炎组较无组织学绒毛膜炎组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞显著下降[1.68(1.15-2.68)% vs 3.34(2.71-5.05)%](P<0.01)。早产患者不管有无组织学绒毛膜炎该类细胞含量均较正常妊娠对照组显著降低(P<0.01),而早产无组织学绒毛膜炎组与足月临产组比较则无统计学差异(P>0.05)。6.正常妊娠对照组、先兆早产组与早产临产组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平分别为(0.632±0.092)、(0.477±0.156)和(0.168±0.085),可见早产临产组较先兆早产组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平降低,有显著统计学差异(P<0.01),而先兆早产组较正常妊娠对照组比较Foxp3 mRNA表达水平也明显下降(P<0.01)。7.早产有组织学绒毛膜炎组蜕膜组织Foxp3 mRNA及蛋白表达水平较无组织学绒毛膜炎组明显下降[(0.146±0.020) vs (0.228±0.016)、(0.141±0.030) vs (0.246±0.030)] (P均＜0.01)。早产无组织学绒毛膜炎组蜕膜组织Foxp3 mRNA及蛋白表达水平与足月临产组比较则无统计学差异(P均>0.05)。结论：足月及早产孕妇体内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量均减少,提示免疫负调节功能减弱,可能与分娩发动相关。第三章PD-1中和抗体对孕鼠孕龄及分娩间隔的影响及其机制探讨目的：建立妊娠小鼠模型,运用PD-1中和抗体阻断技术,研究PD-1介导的CD4+CD25+Treg细胞免疫调节功能对孕鼠孕龄及分娩发动进程的影响,以探讨Treg细胞在分娩发动中的可能作用机制。方法：1.建立孕龄准确的孕鼠模型,将其随机分为PD-1中和抗体组、IgG组和生理盐水组三组,每组各6只,于孕5,8,11,14天按组别不同分别腹腔注射PD-1中和抗体250μg.IgG 250μg或等量生理盐水。2.随机选6只未合笼雌鼠及6只尚未药物干预的孕鼠,颈椎脱臼法处死后取脾脏,分离脾脏单个核细胞,流式细胞术检测妊娠前后CD4+ CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的比例及PD-1在CD4+CD25+Treg细胞中表达情况变化。3.观察PD-1中和抗体干预后对孕鼠孕龄及分娩间隔的影响。4.应用半定量RT-PCR和Western blot检测PD-1中和抗体干预后对孕鼠胎盘组织Th1细胞因子(TNF-α,IFN-γ).Th2细胞因子(IL-4, IL-10)mRNA及蛋白表达水平的影响。结果：1.小鼠妊娠前、后脾脏单个核细胞中CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比分别为(5.88±0.84)%、(13.89±1.69)%,可见小鼠妊娠后脾脏单个核细胞中CD4+CD25+Treg细胞含量显著上升(P<0.01)。小鼠妊娠前、后PD-1占CD4+CD25+Treg细胞阳性比例分别为(6.41±0.90)%、(7.40±0.86)%,小鼠妊娠后PD-1占CD4+CD25+Treg细胞比例上升,但无统计学差异(P>0.05)。2.PD-1中和抗体对孕鼠孕龄的影响：在PD-1中和抗体组,IgG组,生理盐水组三组小鼠孕龄分别为(19.74±0.40),(20.14±0.45)和(20.00±0.26)天,可见三组孕鼠孕龄均>19天,无早产发生。PD-1中和抗体组孕龄稍短于其他两组,但三组间无统计学差异(P>0.05)。3.PD-1中和抗体对孕鼠分娩间隔的影响：在PD-1中和抗体组,IgG组,生理盐水组三组孕鼠分娩间隔依次为(5.78±1.68),(7.86±1.58)和(8.03±1.64)分钟,可见PD-1中和抗体组孕鼠分娩间隔比IgG组和生理盐水组缩短,有统计学差异(P均<0.05),IgG组与生理盐水组比无统计学差异(P>0.05)4.PD-1中和抗体影响分娩间隔的可能机制：1)孕鼠胎盘组织IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γmRNA在PD-1中和抗体组,IgG组,生理盐水组相对表达水平分别为(0.13±0.03,0.17±0.04,0.18±0.04)、(0.14±0.05,0.20±0.02,0.21±q.04)、(0.39±0.06,0.29±0.06,0.31±0.07)、(0.36±0.07,0.27±0.04,0.26±0.04),可见PD-1中和抗体组胎盘组织IL-4 mRNA、IL-10 mRNA表达水平与其余两组比较明显下调,有统计学差异(P均<0.05)；而PD-1中和抗体组胎盘组织TNF-αmRNA、IFN-γmRNA表达水平则较另外两组上调(P均<0.05)。2)孕鼠胎盘组织IL-4、IL-10、TNF-α和IFN-γ蛋白在PD-1中和抗体组,IgG组,生理盐水组相对表达水平分别为(0.13±0.02,0.22±0.04,0.19±0.04)、(0.16±0.04,0.22±0.03,0.21±0.05)、(0.41±0.06,0.33±0.05,0.31±0.07)、(0.36±0.06,0.29±0.04,0.28±0.04),可见PD-1中和抗体组胎盘组织IL-4蛋白、IL-10蛋白相对表达水平与其余两组比较明显下降,有统计学差异(P均<0.05)；而PD-1中和抗体组胎盘组织TNF-α蛋白、IFN-γ蛋白相对表达水平比另外两组上升,有统计学差异(P均<0.05)。结论：1. CD4+CD25+调节性T细胞表面可以表达PD-1。2.PD-1中和抗体干预后引起孕鼠体内Th1/Th2细胞因子平衡失调,进而缩短分娩间隔,加速分娩进程。