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漆酶(Laccase.EC.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶,广泛分布于植物、真菌、昆虫、细菌中,特别是真菌中的白腐菌研究最多。与木质素的降解作用有关,能催化许多化合物的氧化反应,其作用底物比较广泛,包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。近年来,由于漆酶在造纸工业、环境保护、纺织工业、生物资源利用、有毒环境污染物转化、新能源开发和护肤品等诸多领域具有潜在的应用价值。偏肿革裥菌是我国东北林区常见的一种多孔菌目多孔菌科的白腐真菌,在其培养特性、分解木质素酶系统的产酶活性、染料降解以及纯化、MnP的cDNA基因克隆和序列分析、并将该mnp基因转化毕赤酵母中实现了异源表达方面已有研究,但是对于该菌种另一种降解木质素的主要酶系漆酶的研究尚属空白。本研究以高漆酶活性的偏肿栓(Lenzites gibbosa)菌种为基因供体,克隆得到漆酶同工酶Lg-Lacl和Lg-Lac2的cDNA基因及其基因组全长,并且通过荧光定量RT-PCR研究Lg-Lac1和Lg-Lac2基因的表达量。进而构建其诱导型表达毕赤酵母载体,并通过电击转化毕赤酵母,获得有效表达漆酶基因的工程菌。主要研究结果如下：1.通过普通的培养基PDA培养菌种,生长6天后,转接到添加漆酶作用底物木屑的LNAS液体培养基中,生长9天后,收集菌丝,用液氮速冻,-80℃保藏,用于后续实验基因组DNA和总RNA的提取。2.采用简并PCR、RT-PCR、RACE、染色体步移方法从偏肿革裥菌的成熟菌丝中克隆得到漆酶同工酶cDNA全长基因,命名为Lg-Lacl和Lg-Lac2,登录号分别为JF817354和JF817353；以及漆酶同工酶基因组全长,命名为Lg-Lacl’和Lg-Lac2’,登录号分别为JF906786和JF906787。Lg-Lacl和Lg-Lac2的cDNA基因分别含有1563bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),起始密码子ATG,终止密码子TAG,编码520aa,5’非翻译区(5’UTR)分别有60个核苷酸和74个核苷酸,3’非翻译区(3’UTR)分别有122个核苷酸和237个核苷酸。Lg-Lac1的cDNA全长基因与彩绒革盖菌Trametes versicolor的漆酶基因同源性评价最高,相似性达81%；Lg-Lac2的cDNA全长基因与毡毛栓菌T. velutina的漆酶基因同源性评价最高,相似性达82%。Lg-Lac1’和Lg-Lac2’的基因全长分别是3934bp和3887bp,其中从起始密码子ATG到终止密码子TAG各包括2106bp和2165bp。Lg-Lac1’和Lg-Lac2’的基因组全长都含有11个外显子和10个内含子,并月Lg-Lacl’和Lg-Lac2’与栓菌Trametes spAH28-2、血红密孔菌Pycnoporus. sanguineus、朱红密孔菌P.cinnabarinus、长绒毛栓菌T. villosa、彩绒革盖菌T.versicolor等漆酶基因序列相似性达到73%-75%。3. Lg-Lacl和Lg-Lac2的cDNA核苷酸组成,G+C含量较高,分别是58.80%和60.27%。以及Lg-Lacl’和Lg-Lac2’的DNA核苷酸组成中G+C含量也较高,分别是55.75%和58.19%。说明Lenzites gibbosa的基因结构较为复杂。氨基酸组成中,Lg-Lac1和Lg-Lac2中丙氨酸含量最高,半胱氨酸、赖氨酸、蛋氨酸含量最少。Lg-Lac1分子量为53.7KD,pI为4.69,带负电荷残基(Asp+Glu)有46个,带正电荷残基(Arg+Lys)有19个,分子式为C1960H2819N464O656S13,总原子数为5813个,不稳定指数为54.25,属不稳定蛋白,脂肪族指数为78.22,总平均疏水性GRAVY (Grand average of hydropathicity)为0.008。Lg-Lac2分子量为53.9KD,pI为5.65,带负电荷残基(Asp+Glu)有42个,带正电荷残基(Arg+Lys)有24个,分子式为C1984H2850N472O668S18,总原子数为5864个,不稳定指数为51.16,属不稳定蛋白,脂肪族指数为83.25,总平均疏水性GRAVY (Grand average of hydropathicity)为0.008。4. Lg-Lac1成熟蛋白信号肽最可能的剪切位点在21～22aa之间,为AYA-AI; Lg-Lac2成熟蛋白信号肽最可能的剪切位点在21～22aa之间,为VVG-AI;该蛋白序列在30～50aa、129～147aa间存有两个疏水区域,跨膜区预测位置也在30～50aa、129～147aa间,这与亲/疏水性预测结果一致。5.克隆得到的Lg-Lacl’和Lg-Lac2’启动子序列中,5’端上游都包含了真核生物启动子的基本转录调控元件,1个TATA-box位于起始密码子,分别位于上游第-93位和第-107位,漆酶基因启动子的基础启动子区分别位于第-55～-104位和第-65～-115位。另外在偏肿革裥菌Lg-Lac1’和Lg-Lac2’的启动子序列中还存在有许多潜在的外源诱导物响应结合元件,CAAT框,Lg-Lac1’分别位于第-359、-445位；Lg-Lac2’分别位于第-702、-776位；AP2元件,Lg-Lac1’位于第-501位；Lg-Lac2’分别位于第-119、-173、-348、-365、-731位；热击元件(CreA)(SYGGRG), Lg-Lacl’位于第-501位；Lg-Lac2’位于第-697位；NIT2元件,Lg-Lacl位于第-121位；Lg-Lac2位于第-154位。6.采用荧光定量RT-PCR技术研究偏肿革裥菌Lg-Lac1和Lg-Lac2基因的表达量。结果表明,Lg-Lac1、Lg-Lac2基因表达量较未经过CuSO4溶液处理的对照有不同程度的上升。月.上升幅度随处理时间的延长先上升后下降。在无Cu2+条件下,Lg-Lacl和Lg-Lac2随着培养时间的延长,表达量无变化；Lg-lac1和Lg-Lac2在Cu2+浓度为4μl,40μl,200μl条件下,第5d表达量最大,其中Lg-lac1分别是第1d的2.3,3.0,6.5倍,Lg-lac2分别是第1d的1.6,2.1,7.1倍；Lg-lac1和Lg-Lac2的第9d和13d明显下降。Lg-lac1和Lg-Lac2在Cu2+浓度为400μl条件下,第9d表达量最大,其中Lg-lac1是第1d的3.5倍,Lg-lac2是第1d的2.9倍,第5d和第13d表达量下降,其中Lg-lac1是第1d的2.4倍和2.9倍,Lg-lac2是第1d的2.1倍和2.0倍。结果证明：培养液中最适铜离子浓度为200μl。7.利用RT-PCR方法克隆得到Lg-Lacl和Lg-Lac2完整CDS基因用于酵母表达,将Lg-Lacl和Lg-Lac2目的基因与pMD18-T载体相连,之后进行双酶切,把双酶切后的Lg-Lacl和Lg-Lac2目的基因与pPICZB载体质粒相连,构建重组质粒pPICZB/Lg-Lacl和pPICZB/Lg-Lac2;通过电转化的方法,将pPICZB/Lg-Lacl和pPICZB/Lg-Lac2重组质粒整合到毕赤酵母中进行漆酶的异源表达,PCR验证结果表明,重组质粒pPICZB/Lg-Lacl和pPICZB/Lg-Lac2已被成功转化到毕赤酵母中。SMD1168H (pPICZB-Lg-lac1)和SMD1168H (pPICZB-Lg-lac2)在BMMY诱导培养基中诱导目的蛋白的表达,菌体量通过在600nm处的吸光值进行测定,重组菌株Lg-lacl和Lg-lac2漆酶的生物量随着时间的延长持续增加,Lg-lacl和Lg-lac2重组菌株在72h时最高漆酶活性达到0.171μ kat/l和0.175μ kat/1,重组漆酶的表达活性较低可能与酵母密码子的偏好性、信号肽的选用和培养条件等因素有关。