PHBV纳米纤维对大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响

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目的:探究静电纺丝制备的聚羟基丁酸戊酸共聚酯(Poly-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate , PHBV)纳米材料对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)粘附、增殖以及向神经元样细胞分化的影响,为PHBV纳米材料与骨髓间充质干细胞联合移植治疗脊髓损伤提供新的依据。方法:取4周龄(100-120g)的SD大鼠,将股骨和胫骨分离出,从中提取骨髓,采用贴壁分离培养的方法分离纯化大鼠BMSCs,待细胞融合80%后1:2分瓶传代,传至第3代时,细胞计数后,以2×104/ml接种至静电纺丝制备的PHBV纳米纤维膜(定向A-NF与非定向R-NF)上,以接种至玻片上为对照组,倒置显微镜下观察对照组细胞形态。用电镜观察细胞与PHBV纳米纤维膜的粘附情况,于培养第1、4、7天时,使用细胞计数试剂盒CCK-8检测各组细胞增殖情况。待细胞与PHBV纳米纤维膜融合后,以维甲酸(RA)作为增殖及分化诱导因子,每孔加入200uL对BMSCs进行增殖培养、分化诱导,倒置显微镜下观察对照组细胞生长形态的变化,于第2、4、6天将各组细胞采用4%多聚甲醛固定,封闭,用Nestin,MAP-2, GFAP抗体行化学染色鉴定神经干细胞,神经元和神经胶质细胞的生成情况。结果:BMSCs与PHBV纳米纤维膜有很好的相容性,定向与非定向PHBV纳米纤维膜均能很好的促进细胞增殖,第1天,A-NF与R-NF表面细胞略多于玻片上的细胞,A-NF与玻片上细胞无统计学意义(P>0.05), R-NF表面细胞与两者皆有统计学意义(P<0.05),第4天及第7天时,A-NF与R-NF表面细胞显著增长,其中R-NF表面细胞增殖显著高于A-NF表面,具有统计学意义(P<0.05),且两者与玻片细胞均有统计学意义(P<0.05)。在A-NF表面的细胞沿纤维方向生长,其形态被显著拉长。加入维甲酸(RA)诱导剂24h后,细胞形态开始变化,胞体开始回缩,突起逐渐伸出。免疫荧光染色示PHBV纤维膜上的细胞在第2天即可检测到Nestin阳性细胞的表达,第4天可检测到MAP-2, GFAP阳性细胞表达,对照玻片组第4天开始表达Nestin抗体,第6天开始表达MAP-2, GFAP抗体。结论:A-NF和R-NF均能很好的促进细胞增殖,有良好的相容性,且R-NF表面细胞增殖显著高于A-NF表面。定向纳米纤维通过引导细胞骨架延伸从而对细胞形貌产生显著影响,使着细胞沿着纤维方向定向生长,这和神经细胞轴突定向生长相符合。PHBV纳米纤维膜能促进BMSCs向神经元样细胞的分化,缩短分化所需的时间。因此,我们认为定向纳米纤维支架可能在神经组织工程中更有优势。
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