食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,国际癌症研究中心(IARC)全球癌症统计报告指出:2012年食管癌发病人数为323,000人;2012年食管癌死亡人数为281,200人,说明其具有高发生率和高致死性的特征。我国是食管癌的高发国家,其中尤以食管鳞癌最为常见。食管癌患者就诊时多处于中晚期,相当部分的病人已不能手术治疗,总的五年生存率仅为10%-20%。为此,探索食管鳞癌发生和发展的分子基础,寻找相关的肿瘤标志物,对于食管鳞癌的早期诊断及治疗具有十分重要的意义。MicroRNA(miRNA)是近年来研究较多的一类内源性、约22个核苷酸长度的非编码RNA,可通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区以促使m RNA降解或者抑制其蛋白翻译,并参与转录后表达调控。研究表明miRNAs在胚胎发育、细胞分化、细胞增殖、凋亡以及肿瘤的发生发展等多种生命过程中均可以发挥作用,在人类疾病中具有潜在的临床诊断和治疗意义。越来越多的研究证实mi RNAs具有癌基因或抑癌基因作用,可直接参与人类多种肿瘤的形成与发展。此外,也有研究表明miRNAs在肿瘤中的异常表达具有一定的组织和细胞特异性。因此,深入研究mi RNAs在人体肿瘤中的表达及其作用功能,对认识不同组织类型肿瘤的发生、发展和转移的机制具有十分重要的意义,同时也将有利于肿瘤的靶向治疗。近年来的研究报道了许多参与食管鳞癌发生发展的miRNAs并阐述了其作用机制,这为探索食管鳞癌发病机理的研究提供了丰富的理论认识。为了寻找新的可能成为诊断指标或治疗靶点的mi RNAs,课题组前期利用食管鳞癌组织及其对应的正常食管组织样本,采用mi RNAs表达谱芯片技术,对食管鳞癌组织中异常表达的miRNAs进行筛选。我们共检测到差异表达的mi RNAs 129条(上调69条,下调60条),其中包含一些已被鉴定过的mi RNAs,例如mi R-21、mi R-9、miR-129、miR-375等。同时,我们结合其他研究组报道的不同肿瘤中的mi RNA表达谱数据以排除一些具有肿瘤广泛性的mi RNAs。最后,mi R-330-3p(Fold change=2.03)和mi R-26b(Fold change=0.49)引起了我们的关注。目前关于mi R-330在肿瘤中表达和功能研究的报道并不多,并且已有结论提示mi R-330在不同肿瘤中的表达有所差异。而对于mi R-26b的研究结果普遍认为它在多种肿瘤中表达下调,可能是个抑癌基因样的mirna分子。然而迄今为止,关于mir-330-3p和mir-26b在食管鳞癌中表达和功能的研究尚未有报道。为此,我们选择这两个mirnas作为后续研究对象。本课题首先研究了mir-330-3p和mir-26b在食管鳞癌细胞系以及肿瘤组织中的表达情况,试图阐明它们在食管鳞癌中的表达特性。然后,采用外源性转染的方法检测过表达或干扰mirnas后食管鳞癌细胞生长、增殖、凋亡以及迁移侵袭等情况,以进一步明确mir-330-3p和mir-26b对食管鳞癌细胞生物学行为的影响。最后,预测并鉴定了mirnas可能发挥作用的下游靶基因,同时也对它们受到的上游转录调控机制进行了初步探讨。本课题的主要研究内容和结果如下:1.mir-330-3p在食管鳞癌中的功能及其调控机制研究1.1mir-330-3p在食管鳞癌中的表达及其生物学功能研究首先采用实时荧光定量pcr方法检测mir-330-3p在食管鳞癌细胞株和组织中的表达情况。结果发现与正常食管上皮细胞het-1a相比,mir-330-3p在两种食管鳞癌细胞株(ec109和kyse150)中均表达上调;35例配对食管鳞癌样本中mir-330-3p在癌组织中表达显著上调。进一步采用cck8实验、流式细胞仪技术、edu细胞增殖实验、transwell细胞迁移侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验对mir-330-3p进行功能分析。在ec109细胞中瞬时转染mir-330-3pmimics和无关对照mimicsnc,结果发现过表达mir-330-3p后,可显著加快ec109细胞生长,促进细胞增殖、迁移和侵袭,并且可抵抗由顺铂引起的细胞凋亡;而在kyse150细胞中转染mir-330-3pinhibitor,与对照inhibitornc相比,干扰了mir-330-3p后可抑制kyse150细胞生长、增殖,诱导细胞g1期阻滞以及增加细胞凋亡的发生。此外,我们还检测了mir-330-3p对食管鳞癌细胞中一些细胞周期相关基因表达的改变。westernblot结果显示增加ec109细胞中mir-330-3p表达水平,可显著上调细胞周期正向调控分子cyclina、cdk6的蛋白表达,同时可下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21、p27的蛋白水平。荧光定量pcr结果也发现mir-330-3p可显著上调ccnd1、ccnd2、cdk4、c-myc的mrna表达。同样地,在kyse150细胞中下调mir-330-3p表达后可观察到相反的效应。最后,裸鼠成瘤实验发现过表达mir-330-3p组的ec109细胞皮下成瘤能力较对照组明显增强。以上体内、体外实验结果均提示mir-330-3p可以促进食管鳞癌细胞生长,说明mir-330-3p在食管鳞癌中可能是个癌基因样的mirna分子。1.2pdcd4是mir-330-3p直接调控的靶基因我们通过targetscan,miranda和pictar等网站进行生物信息学预测发现pdcd4可能受到mir-330-3p的调控。采用荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量pcr及westernblot等方法验证pdcd4是否为参与mir-330-3p调控的下游靶基因。结果发现mir-330-3p无论是在mrna水平或蛋白水平均可降低pdcd4的表达。双荧光素酶报告基因结果显示:含有野生型pdcd43’utr的载体与mir-330-3pmimics共转染后荧光素酶活性显著下降,而突变结合位点后荧光素酶活性有所回升。进一步采用实时荧光定量pcr方法检测pdcd4在食管鳞癌组织中的表达情况,并分析其与mir-330-3p表达的相关性。q-pcr结果显示:与癌旁正常组织相比,pdcd4在35例食管鳞癌肿瘤组织中表达显著下调。通过测定mir-330-3p和pdcd4在食管鳞癌组织和对应的癌旁组织中的mrna表达,我们发现二者表达水平呈负相关(r=-0.5421,p=0.0008)。1.3pdcd4在食管鳞癌细胞中的功能研究采用特异的pdcd4sirna化学片段转染食管鳞癌细胞,分别以cck8实验、流式细胞仪技术、edu细胞增殖实验、transwell细胞迁移侵袭实验检测干扰pdcd4后细胞生物学行为的改变。结果显示在ec109和kyse150细胞中干扰pdcd4表达,细胞生长速度加快、细胞增殖能力、迁移和侵袭能力也明显增强,同时也可抵抗由顺铂诱导的细胞凋亡。上述实验结果均提示pdcd4可能为mir-330-3p发挥功能的潜在下游靶点。2.mir-26b在食管鳞癌中的功能及其调控机制研究2.1mir-26b在食管鳞癌细胞株和肿瘤及癌旁组织中的表达情况mirna芯片结果提示mir-26b在肿瘤组织中表达下调。为了验证这一结果,我们采用sybr-greenqrt-pcr方法检测了mir-26b在42对食管鳞癌肿瘤组织和癌旁组织中的表达情况。结果显示与癌旁正常组织相比,mir-26b在食管鳞癌组织中的表达显著下调。进一步结果显示与正常食管上皮细胞het-1a相比,mir-26b在食管鳞癌细胞株中kyse150和kyse450中也表达下调。2.2mir-26b在食管鳞癌细胞中的生物学功能研究由于mir-26b在食管鳞癌细胞和组织中的低表达,我们进一步采用cck8实验、流式细胞仪技术、edu细胞增殖等实验对mir-26b进行功能分析。结果显示上调mir-26b的表达水平可抑制食管鳞癌细胞生长;edu结果提示过表达mir-26b后实验组细胞增殖能力较对照组明显降低;流式细胞术结果也显示过表达mir-26b组的细胞发生了明显的g1期细胞阻滞,并且干扰了mir-26b后可明显拮抗由顺铂引起的凋亡。以上实验结果提示mir-26b在食管鳞癌中表达下调,并且可以发挥抑制食管鳞癌细胞生长的作用。2.3mycbp可能是参与mir-26b发挥抑制生长作用的下游靶基因鉴于mir-26b在食管鳞癌细胞中发挥的生长抑制作用,我们通过targetscan,miranda和pictar等网站预测其可能发挥功能的下游靶基因。经过筛选,我们发现c-myc结合蛋白mycbp的3’utr可以与mir-26b互补结合。我们在ec109、kyse150和kyse450细胞中分别转染化学合成的mir-26bmimics后发现mir-26b可以显著下调三种细胞中mycbp的mrna表达水平。荧光素酶报告基因实验也进一步提示mir-26b可以通过该结合位点抑制mycbp的转录活性,说明mycbp可能受到了mir-26b的负调控。此外,我们还研究了mycbp在食管鳞癌中的功能。采用特异的mycbpsirna化学片段转染kyse450细胞,分别以cck8、edu细胞增殖实验以及流式细胞术检测干扰mycbp后细胞生物学行为的改变。结果显示kyse450细胞中mycbp被抑制后可以发挥与mir-26b相似的效应,以上均提示mycbp可能是mir-26b发挥作用的潜在下游靶基因。3.nf-κb调控mirnas参与抑制食管鳞癌细胞生长的机制研究3.1mir-330-3p、mir-26b启动子区均含有转录因子nf-κb的结合位点根据ucsc网站提供的sno/mirna数据结合encoderegulation、cpgisland、encodetfbinding以及tfbsconserved等数据发现在mir-330-3p、mir-26b基因启动子区都含有转录因子nf-κbp65的结合位点,此外在相同的位置也显示出很强的ii型rna聚合酶的信号,这些都提示nf-κb很可能参与这两个mirna的转录调控。3.2nf-κbp65对mirnas的表达改变我们在ec109细胞中瞬时转染nf-κbp65表达质粒,q-pcr结果发现过表达p65后可下调mir-330-3p的表达,而上调mir-26b的表达。由此提示在食管鳞癌细胞ec109中,mir-330-3p和mir-26b的表达可能会受到nf-κb的影响。3.3nf-κbp65与mirnas基因调控区结合情况我们通过染色质免疫共沉淀技术(chip)进一步探讨这两个mirnas基因调控区与nf-κb的结合情况。首先,我们在ec109细胞中转染p65后检测nf-κb与mir-330-3p的结合情况,结果显示在该结合位点处nf-κbp65、p50的富集均高于对照组igg。接下来我们针对nf-κb与mir-26b的结合位点设计pcr引物,结果同样显示过表达nf-κb后,该结合位点处p65的富集较对照组显著增高。3.4nf-κb对mir-330-3p转录活性的影响chip实验已经证实nf-κb可以与mir-330-3p基因调控区结合,因此我们推测nf-κb是否也可以影响它的转录活性。我们构建了含有nf-κb和mir-330-3p结合位点的野生型报告基因载体以及相应的突变或缺失该结合位点的荧光素酶报告基因载体进行启动子活性的检测。结果显示NF-κB可以与miR-330-3p启动子区结合并且抑制其转录活性。3.5 NF-κB对PDCD4和C-myc的表达改变由于NF-κB可以调控mi R-330-3p和mi R-26b的表达,我们推测其是否也可以影响miRNA靶基因的表达。分别采用过表达p65或抑制NF-κB活性的策略检测NF-κB对PDCD4和C-myc蛋白表达的影响。结果发现:在EC109和KYSE450细胞中,NF-κB对PDCD4的表达为负调控关系;此外,在两种食管鳞癌细胞中NF-κB对C-myc表达的调控也表现为下调C-myc的蛋白水平。综上所述,本课题主要从以下几方面进行了研究:(1)通过检测mi R-330-3p和mi R-26b在食管鳞癌肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达,试图阐明这两个mi RNAs在食管鳞癌中的表达特性。(2)采用过表达或干扰手段,经体内、体外实验,明确mi R-330-3p和mi R-26b对食管鳞癌细胞的生物学行为的影响,并且鉴定了它们可能发挥作用的潜在下游靶基因。(3)初步探讨了食管鳞癌细胞中mi R-330-3p和miR-26b的表达调控机制,发现其可能参与了NF-κB的调控通路。总之,本课题主要以探索mi R-330-3p和mi R-26b在食管鳞癌中的表达与功能为目标,借助miRNAs可以调控多个靶基因,而其本身表达又可受到转录因子调控的特点,进一步对参与miRNAs发挥功能作用的上、下游调控机制展开了科学研究。本研究有助于理清“NF-κB—miRNAs—靶基因”参与食管鳞癌细胞生长的复杂调控网络,为进一步揭示mi RNAs的分子功能及食管鳞癌的发生发展机制提供新的线索。