食品级乳酸乳球菌表面展示系统的构建与性能分析

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乳酸类细菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类公认的对人体及动物无致病性和无定殖力的、在食品和医药医疗领域具有重要应用价值的食品级微生物,而革兰氏阳性菌(G+)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是其中的一种具代表性的菌种,受到研究者的广泛重视。N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(N-Acetylmuraminidase,AcmA)是乳酸乳球菌的一种主要的自溶素,自1995年被发现以来,国内外对其结构和功能已进行了一定的研究。本研究通过克隆乳酸乳球菌野生型菌株AS1.2829的AcmA编码基因acmAas,然后通过构建该基因部分中断的染色体整合重组工程菌,对该部分缺失基因型的编码活性及其对宿主菌生长和细胞分裂的影响进行了初步考察;在此基础上,利用缺失性AcmAas作为运载蛋白,通过染色体整合作用构建了1株食品级乳酸乳球菌表面展示工程菌。首先通过对已发表的编码acmA基因序列的比对分析,设计特定引物,从乳酸乳球菌菌株AS1.2829中由PCR反应扩增得到其AcmA的编码基因,经测序验证为AcmA编码基因,命名为acmAas。对AcmAas的结构预测结果表明,该蛋白由1个具催化活性的N-末端和1个具细胞壁锚定活性的C-末端结构域组成,其中C-末端又由3个LysM(lysin motif)结构域组成,具有典型的“βααβ”型二级结构。进一步通过体外在acmAas基因中引入红霉素抗性基因(Emr)而构建了可以与与宿主菌染色体acmAas基因进行整合作用的重组质粒pMB257,导入宿主菌L.lactisAS1.2829后,通过含有红霉素的平板筛选得到与宿主菌发生染色体整合重组的重组菌株MB257。通过对生长曲线的测定,菌落形态观察,普通相差显微镜观察和扫描电子显微镜的观察对该菌株的形态与生长特性进行了初步考察,结果表明该菌株所携带的acmAasN-lysM1基因在保留其N端酶催化活性结构域和1个lysM编码区后,其编码产物可发挥其完整生物学活性,不影响菌体的正常生长和分裂,该结果不仅首次证实了单一LysM可以行使独立的细胞壁靶位锚定功能,且所探测的同源重组位点可以用于构建具细胞表面展示活性的染色体整合重组工程菌。为了构建染色体整合的食品级表面展示工程菌,考察了枯草芽胞杆菌(Bacillussubtils)菌株BF7658的一种β-1,3-1,4葡聚糖酶(endo-beta-1,3-1,4-glucanase,GLS)作为重组乳酸乳球菌菌株的食品级筛选标记的可行性。通过将表面展示GLS的乳酸乳球菌工程菌接种在含有燕麦的培养基上,由刚果红染色和NaCl脱色后可以在平板上观察到明显的透明圈,从而证明GLS可作为一种无抗性的筛选标记而用于构建食品级染色体整合重组菌。在此基础上,构建了以GLS为筛选标记和乘客蛋白,以AcmAas作为重组位点和运载蛋白的染色体整合质粒pMB260,在导入乳酸乳球菌受体菌后,以GLS作为筛选标记,筛选到表面展示GLS的染色体表面展示重组工程菌。对重组菌性能的分析测定、以及进一步用于展示其它功能性外源蛋白的工作仍然在进行中。
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