研究背景：体外杀精剂是控制生育和避孕的有效手段,其中壬苯醇醚-9(Nonoxinol-9,N-9)因其具有强大的杀精效果而成为广泛接受的表面活性剂类杀精剂,已经在美国和其它一些国家使用超过了30年。作为一种有效的杀精避孕阴道外用生物制剂,除了拥有快速有效的杀精避孕性质之外,安全低毒也非常重要。但近年来有研究表明,N-9存在安全隐患,长期反复使用可能会对阴道上皮细胞造成损伤,所以尽快研制新型安全的杀精避孕剂已迫在眉睫。抗菌肽(Antimicrobial peptides)是广泛存在于生物体内的一类抵抗外源性病原微生物致病作用的防御性小分子多肽(分子质量<10ku),是宿主固有免疫系统的重要组成部分。每种抗菌肽都有其特定的抗菌谱,部分抗菌肽还兼具杀精子作用。两栖动物蛙类的皮肤分泌物中含有丰富的抗菌多肽,在抗菌、抗肿瘤、抗病毒和杀精等方面都展现出了强大的功能,并已在农业及临床等方面有所应用。目前,国外关于杀精抗菌肽的报道如Magainin、Dermaseptins、Nisin和Subtilosin等几种抗菌肽都显示出较强的体外杀精效果,如800～1000mg/L Magainin20s就能制动(immobilization)猴的精子(浓度为60X106/mL-80X108/mL),值得注意的是,Magainin在最小杀精浓度时,未对红细胞和阴道粘膜细胞产生毒性,显示出较高的安全性。因此,抗菌肽成为近年来国内外研发的热点。其中线性阳离子多肽Maximin是赖仞课题组最早从中国大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中分离提取的具有自主知识产权的先导化合物,特别是Maximin和同浓度的Magainin具有相似的精子制动活性,故成为本实验杀精分析首选抗菌肽。本文通过对19种抗菌肽Maximin衍生物(M1-M19)进行体外杀精和细胞毒性作用的评价,筛选出有望成为安全、有效的新型体外杀精剂的候选物。研究目的：1.通过对Maximin的19种衍生物(M1-M19)的体外杀精作用和细胞毒性分析,筛选出具有较强杀精效果和低细胞毒性的抗菌肽；2.通过家兔抗生育实验,探索筛选出的高效、低毒抗菌肽的抗生育作用并对其体内安全性进行初步评价；3.初步探索杀精抗菌肽的杀精机制及其抗菌活性。研究路线和方法：1.精液采集及分析：精液样品来源于北京市人类精子库。选择育龄、健康和有正常生育史的男性志愿者48例,年龄为25～35岁,取精前禁欲72h,手淫法获取精液(精液量>2mL),于37℃C保温液化30mmin-。液化后进行常规分析,严格按照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》第五版推荐的标准执行,其中精子总数60×106～100×106,精液浓度>20×106/mL,精子活动率>60%。2.体外杀精效果实验：按照WHO推荐的Sander-Cramer方法,精液与抗菌肽以1：5迅速混合,37℃C水浴20s,显微镜下随机观察计数5个视野,再以伊红-苯胺黑染色技术观察精子细胞的存活,筛选出具有较强杀精作用的抗菌肽衍生物。同时测定杀精抗菌肽和N-9的EC100。最后观察测定杀精抗菌肽的时间-浓度依赖性。3.细胞毒性研究：采用CCK-8试剂盒检测细胞毒性,对抗菌肽衍生物和N-9进行细胞毒性分析,评价N-9的细胞毒性并筛选出细胞毒性较低的抗菌肽衍生物,并计算它们的IC50值。4.家兔抗生育实验：采用阴道内给药的方法向雌性育龄新西兰大耳白兔阴道内注入杀精剂量的抗菌肽溶液,交配后观察统计兔子怀孕情况。生理盐水为阴性对照,N-9为阳性对照。相同组分观察阴道内给药后,兔红细胞溶血情况。5.杀精机制初探：采用HOS-EG实验方法了解杀精抗菌肽杀精后精子膜破坏情况。6.抗菌实验：微量稀释法检测杀精抗菌肽候选衍生物对白色念珠菌和大肠杆菌的抗菌作用效果。研究结果：1.19种抗菌肽Maximin衍生物(M1-M19)中M1、M7、M1、M15和M17这五种抗菌肽在浓度为2000mg/L、作用时间为20s时就能完全制动精子,ECloo分别是：M7=M11=2000mg/L,Ml=M15=M17=1500mg/L。N-9的EC100=100mg/L。2.利用Hela-229细胞分析细胞毒性时,M11的细胞毒性明显低于其它四种抗菌肽,表现出较高的安全性。N-9具有强大的细胞毒性,IC50=3.01mg/L。3.杀精抗菌肽衍生物M11的家兔抗生育实验结果显示M11药物组的活胎数和避孕率与阴性对照组相对比均无统计学意义。4.HOS-EG实验结果显示,杀精抗菌肽和N-9对精子的细胞膜完全破坏；M11对精子的破坏主要集中的精子尾部,而M15和M17对精子的损伤基本上都是头尾共同破坏,这种作用方式类似于N-9。5.微量稀释法分析杀精抗菌肽衍生物M11的抗菌活性,结果在浓度50mg/L时并未对大肠杆菌和白色念珠菌产生杀菌作用。结论：1.19种抗菌肽Maximin衍生物(M1-M19)中M1、M7、M1、M15和M17这五种抗菌肽具有较强的体外杀精效果；2.细胞毒性实验表明M1、M7、M11、M15和M17这五种抗菌肽的细胞毒性大小分别是：M11<M15<M17<M7<M1。其中抗菌肽M11表现出几乎无细胞毒性的特点,安全性最高；3.杀精抗菌肽(M11、M15和M17)具有明显的杀精作用时间-浓度依赖性特点；HOS-EG实验表明,抗菌肽杀精作用是通过破坏精子细胞膜而实现的。4.杀精抗菌肽衍生物M11未能实现对家兔抗生育的目的。5.杀精抗菌肽衍生物M11对白色念珠菌和大肠杆菌的抑菌实验中未观察到抑制现象。