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研究背景血管钙化是老年人以及患有慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)和糖尿病人群中的普遍问题。血管钙化会导致血压波动、斑块破裂、血栓形成等严重后果。由于动脉血管钙化的机制复杂多样化,且尚不明确,目前尚无有效的针对性治疗手段。但血管钙化过程中包括被动因素和主动因素,与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)或内皮细胞(endothelial cells,ECs)的成骨转分化、炎症、凋亡或外泌体的释放均紧密相关。关于血管钙化的研究多聚焦于转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)家族分子。近年来,生长分化因子11(Growth differentiation factor 11,GDF11)作为TGF-β家族新成员表现出积极的作用。有研究表明外源GDF11可通过smad2/3信号通路抑制骨髓间质干细胞成骨分化及胰岛β细胞凋亡。据目前GDF11相关研究结果推测GDF11可能对血管钙化亦有作用,但目前尚未见相关报道。因动脉血管中主要包括内皮细胞和平滑肌细胞,本研究拟用β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗坏血酸分别诱导人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cell,HAEC)、人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)钙化,并探究外源GDF11对HAEC成骨分化、内皮向间质转分化、钙化的影响,同时探究外源GDF11对同作为血管壁主要细胞之一的HASMC成骨分化、表型转化、凋亡、钙化等的影响,揭示GDF11对HAEC、HASMC钙化的影响及可能的机制,为治疗或预防血管钙化提供更多可能。研究目的1.探讨外源GDF11对HAEC钙化的影响及对钙化过程中成骨分化、内皮向间质转分化的影响2.探讨外源GDF11对HASMC钙化的影响及钙化过程中平滑肌细胞的成骨分化、表型转化、凋亡的影响研究方法1.HAEC样本钙化相关蛋白、基因及样本中GDF11表达水平检测:以β-甘油磷酸为变量分为3组:(1)空白组;(2)低浓度β-甘油磷酸组(10mmol/Lβ-甘油磷酸+100nmol/L地塞米松+50ug/ml L-抗坏血酸);(3)高浓度β-甘油磷酸组(30mmol/Lβ-甘油磷酸+100nmol/L地塞米松+50ug/ml L-抗坏血酸)。对HAEC进行钙化诱导10 d后,western blot检测样本BMP2、BMP4、GDF11的蛋白表达水平,RT-PCR检测HAEC的Runx2、Osterix、GDF11的基因表达水平。2.细胞免疫荧光检测HAEC中GDF11的表达:以30mmol/Lβ-甘油磷酸+100nmol/L地塞米松+50ug/ml L-抗坏血酸刺激HAEC 10d后,用细胞免疫荧光法检测胞内GDF11的表达;3.以不同浓度和作用时间的GDF11干预为变量,探讨外源重组GDF11干预HAEC钙化的有效浓度及时间。HAEC:(1)以GDF11预处理48h,再予钙化诱导10 d,按浓度梯度分为5组:(1)空白组,(2)钙化组,(3)30 ng/ml组(30 ng/ml GDF11),(4)50 ng/ml组(50 ng/ml rh GDF11),(5)100 ng/ml组(100 ng/ml GDF11);(2)以100 ng/ml GDF11干预,再予钙化诱导10 d,按时间梯度分5组:(1)空白组,(2)钙化组,(3)GDF11处理8 h组,(4)GDF11处理24 h组,(5)GDF11处理48 h组;用Western blot检测各组样本BMP2、BMP4的蛋白表达水平;4.筛选出GDF11有效干预浓度与时间后,HAEC分4组进行后续实验:(1)空白组(常规培养12 d),(2)GDF11组(予100 ng/ml GDF11预处理48 h,再常规培养10 d),(3)钙化组(常规培养2 d后,予钙化诱导10 d),(4)GDF11+钙化组(予100 ng/ml GDF11预处理48 h,再钙化诱导10 d)。Western blot检测BMP2、BMP4、α-SMA、VE-Cadherin的蛋白表达,RT-PCR检测Runx2、Osterix的基因表达水平,细胞免疫荧光检测α-SMA、VE-Cadherin的表达,茜素红检测钙化沉积(茜素红染色的样本钙化诱导21d);5.HASMC样本钙化相关蛋白、基因及样本中GDF11表达水平检测:将HASMC分为2组:(1)空白组;(2)10mmol/Lβ-甘油磷酸+100nmol/L地塞米松+50ug/ml L-抗坏血酸组;HASMC进行钙化诱导14 d后western blot检测样本中Runx2、BMP2、BMP4、GDF11的蛋白表达水平,RT-PCR检测样本的Runx2、Osterix、GDF11、ALP、BMP2、BMP4基因表达水平;6.以不同浓度和作用时间的GDF11干预为变量,探讨外源重组GDF11干预HASMC钙化的有效浓度及时间。HASMC:(1)以GDF11预处理48 h,再予钙化诱导14 d,按浓度梯度分为6组:空白组,钙化组,30 ng/ml组(30 ng/ml GDF11),50 ng/ml组(50 ng/ml GDF11),100 ng/ml组(100 ng/ml GDF11),(6)200 ng/ml组(200 ng/ml GDF11);(2)以100 ng/ml GDF11预处理,再予钙化诱导14 d,按时间梯度分6组:(1)空白组,(2)钙化组,(3)GDF11处理4h组,(4)GDF11处理8 h组,(5)GDF11处理24 h组,(6)GDF11处理48 h组;用Western blot检测各组样本Runx2、BMP2、BMP4的蛋白表达水平;7.筛选出GDF11有效干预浓度与时间后,HASMC分别分4组进行后续实验:(1)空白组(常规培养16 d),(2)GDF11组(予100 ng/ml GDF11预处理48 h,再常规培养14 d),(3)钙化组(常规培养2 d后,予钙化诱导14 d),(4)GDF11+钙化组(予100 ng/ml GDF11预处理48 h,再钙化诱导14 d)。Western blot检测Runx2、BMP2、BMP4、α-SMA、OPN、Bcl-2、Bax、Caspase3、cleaved-Caspase3蛋白表达水平,细胞免疫荧光检测α-SMA、OPN的蛋白表达,RT-PCR检测ALP、BMP2、BMP4、Runx2、Osterix的基因表达水平,茜素红S染色检测钙化沉积(茜素红检测样本诱导钙化21d);结果1.HAEC钙化模型的建立及钙化对内源GDF11表达的影响:Western blot结果提示,高浓度β-甘油磷酸组的BMP2、BMP4、GDF11蛋白表达水平较空白组升高(P均<0.05);RT-PCR结果显示,高浓度β-甘油磷酸组的Runx2、Osterix、GDF11的基因表达水平较空白组升高(P均<0.05);细胞免疫荧光结果提示,高浓度β-甘油磷酸组的GDF11蛋白表达较空白组及低浓度β-甘油磷酸组强。后续实验中钙化组即高浓度β-甘油磷酸组的诱导方案;2.外源GDF11对HAEC钙化有效作用浓度和时间:Western blot结果显示,100ng/ml GDF11预处理48 h,HAEC的BMP2、BMP4蛋白表达下调(P均<0.05),后续GDF11处理组均以100 ng/ml GDF11预处理48 h作为GDF11有效干预浓度和时间;3.外源GDF11对HAEC钙化相关蛋白、钙化沉着、内皮向间质转分化的影响:Western blot结果显示,GDF11+钙化组BMP2、BMP4蛋白表达水平均低于钙化组(P均<0.05),GDF11组BMP2、BMP4蛋白表达水平与空白组无统计学差异;Western blot结果显示,GDF11+钙化组α-SMA蛋白表达水平均低于钙化组(P<0.05),GDF11组α-SMA蛋白表达水平与空白组无统计学差异,GDF11+钙化组VE-cadherin蛋白表达水平均高于钙化组(P<0.05),GDF11组VE-cadherin蛋白表达水平与空白组无统计学差异;α-SMA、VE-cadherin蛋白的细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致;茜素红S染色提示,GDF11+钙化组钙化沉积少于钙化组;RT-PCR结果显示,GDF11+钙化组Runx2、Osterix基因表达水平较钙化组下降(P均<0.05),GDF11组Runx2、Osterix基因表达水平与空白组无统计学差异;4.HASMC钙化模型的建立及钙化对内源GDF11表达的影响:Western blot结果显示,10mmol/Lβ-甘油磷酸+100nmol/L地塞米松+50ug/ml L-抗坏血酸刺激HASMC14 d可诱导钙化。Western blot结果显示,钙化组的Runx2、BMP2、BMP4、GDF11蛋白表达水平均高于空白对照组(P均<0.05);RT-PCR结果显示,钙化组BMP2、BMP4、Runx2、Osterix、ALP、GDF11的基因表达水平较空白组上升(P均<0.05);5.外源GDF11对HASMC钙化有效作用浓度和时间:Western blot结果显示,100ng/ml GDF11预处理24 h,HASMC的BMP2、BMP4蛋白表达下调最显著(P均<0.05)。因为HASMC培养过程中每48 h换一次液,后期实验便以100 ng/ml GDF11预处理48 h作为GDF11有效干预浓度和时间;6.外源GDF11对HASMC钙化相关蛋白/基因、钙化沉积、凋亡、平滑肌细胞表型转化的影响:Western blot结果显示,GDF11+钙化组Runx2、BMP2、BMP4蛋白表达水平均低于钙化组(P均<0.05),GDF11组Runx2、BMP2、BMP4蛋白表达水平较空白组无统计学差异;RT-PCR结果显示,与钙化组比较,GDF11+钙化组BMP2、BMP4、Runx2、Osterix、ALP基因表达水平均下降(P均<0.05),GDF11组相应基因表达水平较空白组无统计学差异;茜素红S染色显示,GDF11+钙化组钙化沉积少于钙化组,但GDF11组较空白组无统计学差异;Western blot结果显示,GDF11+钙化组促凋亡蛋白Bax、Caspase3、cleaved-Caspase3蛋白表达水平均低于钙化组(P均<0.05),GDF11+钙化组的Bcl-2蛋白表达水平较钙化组升高(P均<0.05),但GDF11组Bax、Caspase3、cleaved-Caspase3、Bcl-2蛋白表达水平与空白组比较无统计学差异;Western blot结果提示,GDF11+钙化组的OPN蛋白表达水平较钙化组下降(P均<0.05),GDF11+钙化组的α-SMA蛋白表达水平较钙化组上升(P均<0.05),但GDF11组的α-SMA、OPN蛋白表达水平较空白组无统计学差异;细胞免疫荧光结果显示,GDF11+钙化组α-SMA荧光强度高于钙化组、OPN荧光强度弱于钙化组,但GDF11组与空白组比较无明显荧光强度差异;GDF11+钙化组Runx2荧光强度低于钙化组,但GDF11组与空白组比较无明显荧光强度差异;结论1.β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗坏血酸的混合钙化诱导液可刺激HAEC、HASMC成骨分化、钙化;2.在HAEC、HASMC钙化过程中,GDF11的蛋白及基因水平均上调;3.外源重组GDF11可抑制HAEC的成骨分化、钙化,同时抑制钙化过程中所发生的内皮向间质转分化;4.外源重组GDF11可抑制HASMC的成骨分化、钙化,同时抑制钙化过程中所发生的平滑肌细胞收缩型向合成型转化、凋亡。