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甲烷氧化菌本身固有的酶系具有转化甲烷,生成甲醇、甲醛、甲酸等一系列碳—化合物的功能。本文深入系统地研究了甲烷氧化菌转化甲烷使其羟基化的过程。
作者从河道淤泥中筛选出的菌株Methylomonas sp.QJ16,根据生理生化特性以及16SrDNA鉴定,此菌株隶属于甲基单胞菌属。在对菌株生长特性以及转化甲烷能力的实验中发现,当温度、初始pH值、碳源(甲烷+空气)、磷酸盐(磷酸二氢钾、磷酸氢二钠混合物)、氮源(硝酸钾和氯化铵混合物)分别为30℃、6.46、30%甲烷、0.25g/L、0.74g/L时,培养的甲烷菌株获得最高的浓度;同样的条件下,甲烷转化率获得最高值。实验发现金属离子的浓度对菌株转化甲烷的影响显著,当Cu2+、Mg2+、Na+、Fe2+浓度分别为40μM、4mM、10mM、140μM时,菌株Methylomonas sp.QJ16利用甲烷的能力最大。当底物甲烷的浓度为30-40%(甲烷+空气)时,Methylomonas sp.QJ16对于甲烷的转化率达70%以上,高于目前国内已发现菌株的转化能力。
以甲烷羟基化产物甲醇为衡量目标,对甲烷微生物转化过程中的适宜发酵培养基和最优培养条件进行探讨。
首先利用单因子实验,得到发酵培养基的必要成分,在此基础上利用PB实验和响应面分析方法对发酵培养基的成分和比例进行优化,结果发现,氮源、pH、EDTA的交互作用对甲醇累积的影响高度显著,可信度为99%,金属离子的浓度对于甲醇累积的影响显著。
利用单因素实验和正交实验设计的方法对液体发酵条件进行优选,结果发现,与菌株浓度最高和甲烷转化率最高时的温度条件不同,获得产物甲醇积累量最高时的反应温度为32℃、这可能与甲烷单加氧酶的酶活特性有关;转速、接种量、发酵时间、装液量以及维生素类外源因子对甲醇的累积影响显著,尤其需要注意的是维生素B12、叶酸和核黄素B2这三种外源因子使菌株的稳定期生长量为1mg/mL左右,比添加前增加10-20%,并且维生素B12和核黄素B2这两种因子能使甲醇的累积量增加10%,这可能是因为维生素类外源因子的加入促进了菌株细胞中辅酶活性的增加,从而增加了甲烷单加氧酶的活性。
对甲烷羟基化过程的发酵工艺及反应器模式进行了研究。发酵工艺包括在1L反应器中进行的间歇发酵和在膜反应器中进行的连续发酵两部分。对于甲烷氧化菌株的间歇发酵来说,在1L反应器中,搅拌速度是一个重要参数,转速为180r/min时最有利于菌株Methylomonas sp.OJ16的发酵过程;甲烷在混合气(甲烷和空气)中的比例以及气相压力对于发酵过程影响显著,当甲烷浓度为30%、气相压力为0.12MPa时最有利于甲醇的积累。利用膜反应器验证了连续制取甲醇的可能性,与间歇发酵相比,膜反应器发酵过程具有甲醇累积持续时间长的特点,可大大提高菌体的使用率,如在稀释率为0.1h-1时,甲醇的体积产率为0.19mmol/(L·h),比间歇发酵提高10倍左右。
对间歇发酵和连续发酵动力学过程进行了分析研究。间歇发酵中甲烷氧化菌体生长、产物甲醇生成以及底物甲烷消耗分别用Logistic模型、相关模型和Leudeking—Piret-Like模型进行描述。
结果显示,菌株生长和产物生成的动力学模型能较好地拟合实际过程,而甲烷消耗模型的相对误差较大。采用物料衡算,对连续发酵过程的动力学模型进行分析和非线形模拟,得到的菌体生长和产物甲醇累积的数学模型能基本上反映膜反应器中连续发酵过程的动力学特征。