股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是由遗传因素与环境因素共同作用引起的复杂病。ONFH病理过程复杂，病因及发病机理尚不完全清楚，早期诊断困难，最终不得不进行人工关节置换,一直是骨科临床难治性疾病之一。鉴于近年来ONFH发病率呈逐年增加的趋势，及早阐明ONFN分子病因学及其分子发病机理，使其防治时段前移，是控制ONFH发病率的关键。近年来ONFH分子发病机理研究进展的重要标志之一，是陆续提出了纤溶酶原激活/抑制系列、血管生成系列、脂代谢系列、Ⅱ型胶原系列、细胞因子系列、生长因子系列等数十个基因多态性与ONFH的发病风险相关，它们或者与另外一些基因形成连锁不平衡共同影响ONFH的发病，或者影响其他易感基因的表达功能，在ONFH的发生发展中起协同作用。这些遗传分子病因学研究结果清晰地提示，ONFH属于多个微效基因联合参与、并由环境因素诱导的复杂病。与符合孟德尔遗传规律的单基因病不同，在一个ONFH患病的个体中究竟存在多少个易感基因？每组易感基因对应的临床表现型是什么？需要多少个易感基因的累积最终引起或加重ONFH的发生发展？这些问题的回答要比孟德尔遗传病复杂得多。基因多态性的信息是海量的，寻找ONFH易感基因的研究往往需要大样本量多基因位点的分析，并确认其与ONFH发生发展及其临床表型的相关性，这也是ONFH分子发病机理研究较为滞后的原因之一。目前，国内外关于ONFH的基因多态性研究领域存在的主要瓶颈问题：①零散研究基因位点的资料多，系统研究多基因位点的资料少，不利于多种微效基因联合致病的分子病因学与分子发病机理的阐述；②仅限于单纯的SNPs位点分型的多，与ONFH临床表型的相关研究少，难以确认SNPs位点与ONFH发生发展的联系；③单纯报告基因突变位点的研究多，对基因突变后的表达效率及基因功能的阐述较少，无法进一步明确突变基因位点在ONFH发生中的作用。④尤为重要的是骨代谢重要信号通路的发现与功能研究，为阐述ONFH的分子病变基础提供了前所未有的机遇，但是到目前为止，尚未见到相关骨代谢信号通路系列基因多态性与ONFN发病风险的报告。这些瓶颈问题难以使ONFH分子病因学的最新成果与临床防治实施对接，是阐述ONFH分子发病机理进展的束缚，也是ONFH分子病因学研究亟待解决的关键问题。本文建立在ONFH分子发病机理进展与存在瓶颈问题的基础上,联合应用临床分子诊断技术的创新集成，分别阐述：①优选骨代谢关键基因启动子区或编码区的Tag SNPs作为研究的靶位点，系统阐述其基因分型、等位基因频率、单倍体型、多基因之间的交互作用与ONFH发病风险的关联，阐述ONFH遗传易感分子靶点；②研究Tag SNPs基因分型、等位基因频率、单倍体型与ONFH临床表型的相关性，阐述遗传性易感位点在ONFH发生发展中的作用，解析TagSNPs多态性与临床表型的内在联系；③分析不同基因分型及单体型之间蛋白水平表达的差异，观察基因突变对表达效率及其功能的影响，从整体水平阐述突变位点与基因功能的相关性；④选择骨代谢信号通路系列关键基因Tag SNPs作为研究的靶位点，原始创新性地阐述TagSNPs靶位点分子遗传学与临床表型之间的内在关系,筛查ONFH发生发展密切相关的分子靶点，为建立ONFH的分子水平防治对策提出关键分子靶标，促进分子病因学的研究成果与ONFH的人群防治及早对接。本文研究主要获得如下结果：1.应用LDR及分子测序技术在361例ONFH组及健康对照组体系中成功完成了SREBP-2、IGFBP3、SOX9基因7个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示SOX9基因rs1042667(A/C)-rs12601701(A/G) A-A单体型在ONFH组的分布频率显著低于对照组（P=0.03），提示A-A单体型为保护性单体型，携带A-A单体型的个体可能减低ONFH发病风险。此外，SREBP2rs105271（7A/G）-rs2267439(C/T)-rs2267443(A/G）A-T-G与G-T-A单体型在ONFH组的分布分别具有明显低于对照组（P=0.063)和高于对照组的趋势（P=0.076)。TagSNPs之间交互作用的分析结果发现SREBP2rs1052717（A/G）与IGFBP3rs3110697(A/G)位点之间交互作用与ONFH风险相关（P=0.037),为ONFH多个微效基因联合致病提出了科学依据。2.应用免疫酶联技术分析IGFBP3、IGF-1、SREBP2及SOX-9基因蛋白水平表达的结果,发现ONFH患者组血清IGFBP3蛋白表达水平明显高于对照组（P=0.045），血清IGF-1蛋白表达水平也显著高于对照组（P=0.007）；ONFH组血清SOX9蛋白表达水平极显著低于对照组（P=0.000），不仅率先提出了ONFH患者IGFBP3、SREBP2及SOX-9基因蛋白水平表达异常的证据，而且阐述了ONFH患者靶基因的功能状态，提出了基因多态性影响基因功能的科学依据。尤其惹人注目的是首次发现ONFH患者血清SOX-9水平异常减低。3.在靶基因多态分子分型体系内，证实ONFH组血清TG含量明显高于对照组（P=0.01）,血清LDL-c水平也显著高于对照组（P=0.005），而HDL-c水平则显著低于对照组（P=0.00），LDL-c/HDL-c的比值亦明显高于对照组（P=0.00），在骨代谢关键基因Tag SNPs研究体系中同步提出了ONFH患者血脂代谢显著异常的证据，再次证实了脂代谢紊乱是ONFH的核心发病环节，而且提示了深入解析脂代谢关键基因的突变及其功能状态对ONFH发生发展的重要作用。4.应用生物信息学技术对TagSNPs的基因分型与ONFH的临床表型相关分析结果显示，SREBP-2基因rs2267439的TT型对ONFH临床分期显示统计学意义的趋势（P=0.056）；分别携带IGFBP3rs2453839位点TT型、CT型的ONFH患者，IV病例显著多于III期病例，而携带CC型的患者，IV病例显著少于III期（P=0.017）；基因型与ONFH的病变累计范围也显示出明显相关性，分别携带SOX9基因12601701位点GG型、AG型的ONFH患者，双髋受累病例显著多于单髋受累病例，而携带AA型的ONFH患者，双髋受累病例则显著少于单髋受累病例（P=0.009），提出了IGFBP3、SOX9基因的TagSNPs分别介入ONFH的临床分期及病变范围临床表型的科学依据。5.对SREBP-2、IGFBP3、SOX9的单体型与ONFH临床表型的相关分析结果显示，SOX9rs1042667与rs12601701的两个多态位点所具有的4个单体型中，3个单体型与病变累及范围相关，分别是携带A-A单体型的ONFH患者，双髋病变例数明显低于单髋病变例数（P=0.03)；携带A-G单体型的ONFH患者，双髋病变例数明显高于单髋病变例数（P=0.013)；携带C-A单体型的ONFH患者，双髋病变例数则明显低于单髋病变例数（P=0.048)，从而率先提出了与ONFH临床表型密切相关的SOX9基因单体型。6.率先应用质谱分析技术在377例ONFH组及健康对照组体系中完成了Wnt通路GSK3β、SFRP4基因4个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示SFRP4rs1052981CC型携带者，发病年龄显著早于TC及TT携带者（P=0.05），ONFH组SFRP4C-A单体型的分布具有明显低于对照组的趋势（P=0.073），提示SFRP4C-A单体型可能是一种保护作用的单体型，携带此单体型可能具有减低ONFH发病风险的趋势；GSK3βrs3755557TA携带者，男性患者具有高于女性患者的趋势（P=0.067），分别提出了Wnt信号通路SFRP4、GSK3β的分子遗传学与ONFH临床表型相关的依据。7.应用质谱分析技术完成了RANK/RANKL/OPG通路的OPG、RANK、RANKL、TRAF6、NFATC15个基因10个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果显示ONFH组携带NFATC1rs9518CC基因型的频率具有高于对照组的趋势（P=0.057），NFATC1rs9518TC型携带者，Ⅳ期病变的比例显著高于Ⅲ期（P=0.03）； OPGrs2073617TT型携带者,特发性ONFH的比例显著高于激素性和酒精性ONFH(P=0.02); TRAF6rs5030411(C/T)-rs5030416(C/A)的C-C单体型携带者，双髋病变的比例具有明显高于单髋病变的趋势（P=0.06）；RANKL rs1054016与RANKL rs9525641的交互作用与ONFH发病风险显著相关（P=0.026)。率先阐述了RANK/RANKL/OPG通路多基因位点与ONFH发病风险相关，它们或者以等位基因型或单体型的方式影响ONFH的病因学分类、病变分期以及病变范围，或者以协同作用的方式影响ONFH发病风险，提出了RANK/RANKL/OPG通路与ONFH发病风险相关的分子靶点。8.应用质谱分析技术完成了骨代谢关键转录因子COL2A1、Runx-2、Osterix、成脂分化关键转录因子PPARγ及IGFBP3基因的11个TagSNPs的基因分型、等位基因频率及单体型分析，结果发现不仅ONFH组携带PPARγrs2920502CC基因型的频率显著高于对照组（P=0.0005），而且ONFH组携带PPARγrs2920502等位基因C的频率也显著高于对照组（P=0.0005)，而携带等位基因G的频率则显著低于对照组（P=0.0005),首次提出了ONFH风险密切相关的PPARγ突变位点。研究进一步发现ONFH组携带IGFBP3rs2132572AA基因型的频率亦显著高于对照组（P=0.042）, rs2132572GA型携带者，双侧髋受累的比例显著低于单侧髋（P=0.039）；COL2A1rs2070739AA型携带者的发病年龄显著高于GG型与GA型携带者（P=0.008）； COL2A1的A-T-G-A单体型携带者，双髋病变的比例显著低于单髋病变，提示了多个转录因子的基因多态性协同作用影响ONFH的发生发展，进一步提出了与ONFH发病风险相关的多个分子靶点。9.本研究发现转录因子多个TagSNPs之间的交互作用与ONFH风险显著相关，包括COL2A1rs3809322与COL2A1rs1859444（P=0.043)，COL2A1rs3803183与COL2A1rs3809322（P=0.041), COL2A1rs1859444与Osterixrs4759113（P=0.013)，COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2132572（P=0.006)，COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2854744（P=0.002); COL2A1rs2070739与IGFBP3rs2854746（P=0.006)， COL2A1rs3809322与RUNX-2rs376319（P=0.032)，RUNX-2rs7751427与IGFBP3rs2854744(P=0.009），RUNX-2rs7751427与IGFBP3rs2854746（P=0.005)，充分提示了RUNX-2、IGFBP3、COL2A三个关键基因多个TagSNPs之间的协同作用可能增加ONFH的发病风险，进一步提示多个微效基因的联合影响是ONFH分子遗传学的基本特征。