苦瓜(Momordica charantia L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)苦瓜属(Momordicaa)的一个栽培种,广泛种植于中国,印度以及热带和亚热带地区。苦瓜属于典型的呼吸跃变型果实,其采后寿命非常短。苦瓜果实快速成熟软化影响了苦瓜的质量和货架期,使之丧失商品价值,给农民带来巨大的损失。本研究首先从苦瓜3个基因型中筛选出苦瓜强雌性系’24-K’作为研究对象;构建了苦瓜果实的均一化cDNA文库,并对EST测序和生物信息学分析;从文库中分离出7个与成熟相关的基因;对7个基因进行信息学分析、系统进化树、亚细胞定位、以及它们在果实成熟期的表达分析;对McACS5和McACO2瞬时表达分析;分离出McACS5、McACO2和McGal基因的启动子并进行了表达分析,研究McACO2基因表达调控机制。为探讨苦瓜果实成熟的分子机制,以及苦瓜的遗传改良提供参考。主要研究结果如下:1、以适期采收的3个不同基因型苦瓜为材料,对采后呼吸速率、乙烯释放动态,果实硬度变化和β-半乳糖苷酶活性进行测定,结果表明不同基因型之间存在明显的差异。相关分析表明了苦瓜成熟与呼吸、乙烯代谢、硬度和β-半乳糖苷酶活性之间有紧密的联系。强雌性’24-K’采收后具有硬度下降迅速,乙烯和呼吸同时发生跃变,进入生理成熟易于辨别的特点,筛选出作为研究对象,并将’24-K’苦瓜在成熟过程划分为4个阶段:绿熟期,破色期,转色期和完熟期。2、以24-K苦瓜破色期果实为材料,采用DSN均一化与SMART技术相结合,构建苦瓜果实均一化全长cDNA文库。该文库的转化效率为3,600,000个菌落/μL连接产物,其平均插入片段大小为1.4 kb,重组率为98.0%。随机挑取768个克隆进行EST测序,获得有607个高质量的EST,其中17个contig和562个singleton。冗余率为7.41%,文库的全长率达到了67%。结果表明构建的苦瓜果实均一化文库高效且可靠性好,并发现有若干个与胞内蛋白质降解、细胞壁代谢、乙烯合成、信号传导和抗逆等可能与苦瓜果实成熟软化相关的新基因。3、根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的相关的EST序列,采用3’ RACE技术,从文库中分离出与7个苦瓜果实成熟相关的基因。3.1克隆获得1个苦瓜ACS基因的cDNA序列,命名为McACS5(GenBank:JN860423.1),该序列全长为1194bp,开放阅读框1488bp,编码495aa,相对分子量为55.46 kD,等电点(PI)6.04。3.2克隆获得1个苦瓜ACO基因的cDNA序列,命名为McAC02(GenBank:JQ613285.1),序列全长为1277bp,开放阅读框1037bp,编码317aa,相对分子量为35.85kD,等电点(PI)5.27。3.3分离出1个苦瓜EIN3基因,命名为McEIL2(GenBank:KF595122),该基因全长cDNA序列2122bp,编码629aa,相对分子量为71.58kD,等电点(PI)5.33。3.4分离出1个苦瓜ERF转录因子,命名为McERF1(GenBank:KF595123),该基因cDNA全长960bp,开放阅读框为690bp,编码230aa,相对分子量为24.81KD,等电点(PI)9.3。3.5 克隆获得 1 个苦瓜SAMDC基因,命名McSAMDC(GenBank:KC632099),cDNA全长1 900bp,5’UTR和3’UTR分别长501bp,325bp。的cDNA序列存在3个ORF,mORF长1077bp,编码358aa。3.6克隆苦瓜脂氧合酶基因的cDNA全长,命名为McLOX2(GenBanK:KC733800.1),cDNA全长为2738bp,开放阅读框2538bp,编码845aa。McLOX2蛋白相对分子量为56.28kD,等电点(PI)5.57。3.7 克隆获得 1 个苦瓜β-Gal基因,命名为McGal(GenBank:AFD54987.1),cDNA序列全长为2261bp。开放阅读框2187bp,编码719aa。4、7个苦瓜成熟相关基因生物信息学分析。4.1 McACS5为不稳定的亲水蛋白,存在2个跨膜结构,二、三级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。McACS5的C-端包含有’RLSF’元件和3个丝氨酸残基’S’,属于类型Ⅰ的ACS基因,与McACS1-4的氨基酸序列同源性分别为61.17%,46.99%,61.77%和61.37%。4.2McACO2为稳定的亲水蛋白,二级结构α-螺旋和无规卷曲为主,H177,D179和H234氨基酸残基可能是结合Fe2+的酶活性位点。McACO2与CmACO1,CsACO,CpACO1和CmACO3的氨基酸同源性分别为88.36%、87.11%、84.95%和83.91%。4.3 cEIL2为不稳定的亲水蛋白,该蛋白的N-端氨基酸序列包含了 1个AD、1个PD、5个BDⅠ-Ⅴ、1个核定位信号位点和酶活性中心Lys残基。4.4 McRF1为不稳定亲水蛋白。N-端含有高度保守AP2/ERF的结构域和2个NLS,C端含有EAR基序,该基因属于第Ⅷa类群的ERF转录抑制子。4.5 McSMDC的mORF含有两个保守的功能结构域。McSAMDC氨基酸序列与拟南芥AtSAMDC,琴叶拟南芥AlSAMDC和雪里红BjSAMDC分别达到69%、68%和 68%。4.6 McLOX2为稳定的亲水蛋白。该基因的氨基酸序列具有脂氧合酶特征的3个相对保守特征区域,该基因属于typeⅠ型LOX,具有9-LOX活性。4.8 McGal含有糖苷水解酶家族35的保守结构域,C端不含凝集素结构域。McGal氨基酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、绿豆、大豆、羽扇豆的氨基酸序列的同源性分别达到73%、73%、73%、72%和71%。5、7个苦瓜果实成熟相关基因亚细胞定位。拟南芥叶肉细胞原生质瞬时表达和烟草叶肉细胞瞬时表达结果都表明McACS5蛋白定位于线粒体。烟草叶片表皮细胞瞬时表达结果表明,McACO2在细胞中普遍表达。采用基因枪轰击洋葱叶肉表皮细胞法,结果表明McEIL2和McERF1融合蛋白定位于细胞核中;McSAMDC定位在细胞质中;McLOX2蛋白定位在细胞膜;烟草叶片表皮细胞瞬时表达结果表明,McGaal定位在线粒体上。6、7个苦瓜果实成熟相关基因的表达分析。6.1 McACS5与已知的苦瓜McACS1-4表达分析结果表明,McACS1与McACS5在苦瓜果实成熟绿熟期大量表达,在破色期与转色期稳定表达,推测可能McACS1与McACS5参与了系统Ⅰ和系统Ⅱ乙烯合成。McACS3,McACS4在仅在苦瓜果实绿熟期大量表达,可能参与了系统Ⅰ乙烯合成。McACS2在苦瓜果实膨大期和果实绿熟期表达,McACS2可能主要参与果实发育过程。6.2McACO2该基因在苦瓜果实发育期先升后降,在果实绿熟期表达量最高,然后下降。结果表明McACO2在果实发育阶段受发育的调控,可能参与苦瓜果实系统Ⅰ乙烯生物合成。6.3 McEIL2在果实发育时期先强后弱,直至到绿熟期最低;当果实发生转色,McEIL2基因表达量大幅增加至最高峰值,而后缓慢下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控。6.4 McERF1在苦瓜果实膨大初期和膨大中期大量表达,在果实绿熟期少量表达,可能参与苦瓜果实乙烯生物合成抑制调控。6.5 McSAMDC在果实膨大期表达量最高,并随之迅速下降,并从果实破色期至完熟期该基因表达量逐渐增大。可能参与了系统Ⅱ乙烯合成的调控。6.6 McLOX2在苦瓜果实绿熟期大量表达,此后略有下降,随着果实成熟逐渐上升,至完全成熟达到最高。表明McLOX2参与果实系统Ⅱ乙烯合成,加速果实的成熟进程。6.7 McGal在果实绿熟期表达量最高并随之下降,该基因可能与果实成熟软化初期相关。7、McACS5、McACO2和McGal启动子的克隆与表达。7.1获得的McACS5启动子序列长635bp,其中除包含启动子基本元件外,还获得与生长素、茉莉酸、水杨酸、脱落酸相关表达元件。GUS组织化学染色和定量分析表明McACS5启动子对JA,ABA,SA和ETH诱导显著下调趋势。表明该启动子的表达受JA,ABA、SA和ETH信号负调控。7.2获得的McACO2启动子序列长558bp,还获得与茉莉酸诱导、厌氧诱导、病原体和NaCl诱导相关表达元件。GUS组织化学染色和定量分析表明McACO2启动子在JA,ABA,SA和ETH诱导下呈现出显著上调趋势,表明McACO2启动子表达依赖于JA、ABA、SA和ETH信号通路。7.3获得的McGal启动子序列长1142bp,还发现多个激素以及逆境响应相关的表达元件。McAGalp在JA,ABA,ETH和SA诱导下表现出显著上调趋势。McGal启动子表达依赖于JA、ABA、SA和乙烯信号通路。McACS5,McACO2和McGl的启动子均为诱导型启动子。8、McACS5和McACO2瞬时表达分析。8.1在McACS5基因瞬时表达的苦瓜叶片上,McSAMDC、McERF1的表达量呈显著的下降趋势,McACS3、McACS4、McACO1、McLOX2和McGal表达量呈显著增加,对于McACS1表达量影响不显著。初步表明,在系统系统Ⅰ乙烯生物合成,5个苦瓜ACC合成酶家族基因成员可能是协同作用。8.2 McACO2基因在苦瓜叶片上的瞬时表达,显著抑制了McSAMDC、McACO1、McEIL2、McERF1、McLOX2 表达,增强 了 McGal 表达,对 McACS1、McACS2、McACS3、McACS4表达量影响不显著,McACO2在果实成熟过程中抑制了同源基因McACO1表达。9、McACO2启动子缺失表达分析。构建了 McACO2启动子5’端4种不同长度的GUS融合缺失体,结果揭示了McACO2p应答茉莉酸甲酯的元件可能位于启动子-558bp至-498bp之间,应答乙烯和SA的元件可能位于-498bp至-438bp之间。