传统的光学显微镜受限于光的衍射极限,其空间分辨率难以达到200 nm以内。为了突破这一限制、提高光学显微镜的分辨率,科学家们发展了基于不同策略的超分辨率荧光显微技术,此技术的发展者也因此获得了2014年度的诺贝尔化学奖。在众多的超分辨率荧光显微技术中,光学硬件系统、超分辨算法和生物样本标记是影响其时间、空间分辨率和成像质量的三个主要因素。其中,生物样本的标记方法在过去的十年里获得了长足发展。尤其是各种小分子荧光探针的开发,使超分辨成像技术的分辨率得到了进一步的提升。然而,现有的众多商业化的荧光染料虽然光学性质优异,但由于其本身的不透膜性而无法直接进入活细胞,使其在活细胞超分辨成像领域中的应用受到了很大限制。为了解决以上问题,本文设计和合成了两种分别用于标记活细胞内微丝和溶酶体的透膜有机荧光探针,它们具有“两段式”相结合的结构。另外,本文还将一种光学性质极优异的商业染料发展成为活细胞线粒体探针。主要研究内容如下:(1)设计和合成了两种分别用于标记活细胞内微丝和溶酶体的有机荧光探针,完整的探针结构是由不透膜的商业化染料和无染料的肽段结合而成。其中,无染料的肽段包含了识别基团和细胞穿膜肽,解决了特异性识别的问题和整体探针的透膜问题;而染料部分则可以选用带有活性基团的任何商业化染料,而不必考虑其透膜性。这种设计方式利用了商业染料优异的超分辨性能,并用“两段”相结合的方式增加染料选择的灵活性,降低商业化染料带来的成本。优化确定了探针在活细胞内的最佳孵育条件;并通过搭配使用不同颜色的商业化染料,将以上两种探针成功应用于不同种类的活细胞中,证明了探针的普适性。(2)研究了以上两种探针分别在随机光学重构超分辨成像和结构光照明超分辨成像系统中的成像效果。其中,在随机光学重构超分辨成像实验中,利用活细胞微丝探针Actin-647获得了10 s的时间分辨率和60 nm的空间分辨率;而在结构光照明超分辨成像中,利用活细胞溶酶体探针Lysosome-565表征了半胱氨酸组织蛋白酶在溶酶体内部的不均匀分布,并记录到了完整的溶酶体“融合-分裂”的过程。(3)基于商业化染料Atto 647N,本文发展了一种新的活细胞线粒体探针Mito-647N,具有现有线粒体探针中最佳的亮度和抗漂白能力。将本文新发展的线粒体探针Mito-647N和溶酶体探针Lysosome-565应用于长时程双色SIM超分辨成像中,首次发现了活细胞中溶酶体和线粒体的四种动态相互作用。以上几种探针在超分辨成像中的成功应用,特别是成像分辨率的提高和关于溶酶体和线粒体的新现象的发现,证明了将商业染料应用于活细胞超分辨成像探针的重要意义。