背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以多关节炎为主要表现的慢性自身免疫性疾病,最终导致关节畸形,功能丧失、致残。虽然RA的病因和发病机制还不清楚,但目前所知CD4+T细胞分化为不同的功能性Th细胞亚群,导致机体炎症反应是RA发病的中心环节。Th17细胞是新近发现的一种能特异性产生IL-17的Th细胞亚群,通过IL-17受体等途径作用于效应细胞,造成机体的损坏。因此Th17细胞在RA发病中起关键作用。初始CD4+T细胞向Th17分化依赖于两个方面信号:一是TCR(T细胞抗原受体),二是细胞因子受体。目前对Th17细胞分化的研究集中在激发的细胞因子途径中而对TCR途径研究甚少。而TCR途径是T细胞活化、Th17分化必需的信号之一,因此,从TCR途径出发,研究Th17细胞的分化机制是对其分化途径新的重要探索。TCR信号转导过程中,接头蛋白(adapter proteins)分子起着重要的衔接和调控作用,往往是信号复合体(signaling complex)的核心成分。T细胞接头蛋白(SLAT),是一种鸟甘酸交换因子(GEF),高表达于胸腺细胞和外周血T细胞。SLAT通过效应细胞造成骨质破坏。因此,SLAT通过TCR信号途径在T细胞免疫应答中扮演了崭新和重要角色。目的:1、研究SLAT在活动期RA患者CD4+T细胞中的表达,同时进行SLAT表达水平与外周血、关节液中Th17细胞比例相关分析,观察SLAT在活动期RA患者外周血及关节液与正常人外周血之间的差异。2、检测在诱导刺激后slat及与th17细胞变化的关系。方法:根据2010acr/eular分类标准采集20例活动期ra患者外周血,同时抽取其膝关节关节液作为病例组。并采集15例正常人外周血作为对照组。(1)采集这20例活动期ra患者的空腹静脉血检测血沉(esr)、c反应蛋白(crp)、类风湿因子(rf)、抗环瓜氨酸多肽抗体(acpa)检测并对ra患者关节炎症进行评估计算das28评分。标本用edta抗凝管收集,利用密度梯度离心分别提取外周血单个核细胞(pbmc)和关节液单个核细胞(sfmc)。加入混合刺激液刺激(pma、离子霉素和莫能霉素)4h后加入流式抗体bv510anti-humancd4、pe-cy7anti-humanil-17、同时加入anti-slat后加入二抗donkeyanti-rabbit488上机检测。(2)采集外周血分离pbmc,在诱导th17分化的体外环境中培养、刺激及实施沉默。a组加入t-activatorcd3/cd28;b组加入t-activatorcd3/cd28以及tgf-β、il-23、il–6。c组为沉默组加入cd4aptamer-slatshrnachimera,对slat干扰沉默。放入37℃co2孵箱内培养72h。通过流式细胞术检测slat、th17细胞相关指标在之间的表达差异。(3)分离pbmc免疫磁珠去除分选法分选cd4+t细胞,培养刺激分组同上,收集细胞培养液上清用elisa检测il-17、tnf-α、ifn-γ。用realtime-pcr法检测slat基因的表达水平;利用流式细胞技术检测以计算平均荧光强度mfi表示slat在蛋白水平的表达。(4)观察cd4+t细胞在刺激培养以及沉默后各组中的slat的表达。利用spss20.0软件进行统计学分析。结果:1.正常人外周血slat+cd4+t细胞为(21±2.4)%,活动期ra患者外周血slat+cd4+t细胞为(52±3.6)%,ra患者关节液slat+cd4+t细胞为(47±3.8)%;活动期ra患者外周血及关节液slat+cd4+t细胞高于正常对照组(p<0.01)。2.正常人外周血th17细胞为(0.43±0.14)%,活动期ra患者外周血th17细胞为(1.46±0.21)%,ra患者关节液中th17细胞为(2.01±0.42)%;活动期ra患者外周血及关节液th17细胞高于正常对照组(p<0.01),其中活动期ra患者关节液th17细胞高于ra患者外周血正常血(p<0.05)。3.活动期ra患者外周血th17细胞比例与slat呈正相关(r=0.582,p=0.05)。活动期ra外周血slat与das28评分呈正相关(r=0.732p=0.006)。4.收集pbmc进行流式检测il-17、ifn-γ、tnf-α、rorγt、irf4、slat分别与cd4+t细胞比例;b组细胞比例均高于c组(p<0.01)。a组细胞比例均高于c组(p<0.05)。5.收集上清elisa检测il-17、ifn-γ、tnf-α,a组表达均高于c组(p<0.05);b组表达均高于c组(p<0.01);同时高于a组表达(p<0.05)。6.收集培养cd4+t细胞realtime-pcr检测il-17、ifn-γ、tnf-α、rorγt、irf4、slat;a组表达均高于c组(p<0.05);b组均高于c组(p<0.01)。7.a组mfi为(236±38),b组mfi为(541±24),c组mfi为(105±23);a组表达均高于c组(p<0.05);b组均高于c组(p<0.01);同时高于a组表达(p<0.01)。8.免疫荧光显微镜示CD4+T细胞表达SLAT,沉默SLAT基因后其SLAT表达明显减弱。结论:1.活动期RA患者外周血及配对关节液SLAT+CD4+T细胞的比例均高于正常对照。活动期RA患者外周血Th17细胞的比例与SLAT比例呈正相关。SLAT与DAS28评分呈正相关。而与ECR、CRP、RF、ACPA无明显相关性,从而说明SLTA对RA患者Th17细胞分化有紧密关系,同时SLAT可作为判断RA活动性的指标之一。2.刺激培养CD4+T细胞后,检测Th17细胞相关因子均明显升高。沉默SLAT后检测Th17细胞相关因子水平均明显降低。基因和蛋白水平的表达同时也表现出相同趋势。这说明SLAT在RA患者Th17细胞分化中有推进作用,能够帮助Th17分泌IL-17等炎性因子增强炎症反应。3.活动期RA患者关节液SLAT表达水平较外周血高,提示SLAT在机体不同部位促进Th17分化的作用机制可能不尽相同。