选题依据:中药注射剂结合现代药物制剂工艺与传统中医药理论,具有独特的疗效,全国每年约有4亿人使用,用量持续每年30%的速度上升。然而,该注射剂型引起的不良反应也随之增多。注射用黄芪多糖是上世纪九十年代初山西省中医药研究院根据省内道地药材黄芪资源优势研发的中药静脉用粉针剂,主要用于改善化疗后患者的白细胞水平并增强其免疫功能,且升高白细胞作用稳定而持续,疗效堪比临床首选升白进口药“惠尔血”,成为国内第一个全面提高放化疗患者血象的中成药。由于当时该药开发目的是注射剂,因此采用多次醇沉方法截留获得了黄芪多糖中水溶性较好的一部分(分子量范围约10 kDa～1000 kDa)。虽有指纹图谱进行质控,但作为大分子极性物质组,无明确特异分子构象,药效成分究竟是哪种多糖或特征糖链,药理机制不明确,甚至出现不良反应,很难被国际市场接受。因此,如何找到结构单一、化学结构清晰、药理反应机制明确的黄芪化合物,成为注射用黄芪多糖二次开发的关键。目的:根据注射用黄芪多糖的指纹图谱将其分成两部分多糖,并对两部分多糖进行结构分析。在细胞水平进行体外免疫活性筛选,包括先天性免疫以及适应性免疫,进一步采用细胞代谢组学方法对其免疫机制进行分析。在动物水平进行免疫活性验证,从而筛选出活性多糖,明确其构效关系。研究结果不仅为该药筛选保效降险的新药物提供物质基础,同时为糖生物学深入研究提供分子模型。研究方法与研究内容:通过凝胶过滤层析将注射用黄芪多糖分成两种不同分子量的多糖。运用凝胶渗透色谱法对多糖的分子量进行分析,单糖组成分析采用高效液相色谱法(HPLC-UV),通过甲基化方法确定单糖之间的连接位点,通过红外光谱(IR)分析特征官能团,通过核磁共振波谱(NMR)确定糖苷键构型。注射用黄芪多糖中不同分子量多糖在细胞水平的免疫活性筛选包括测定巨噬细胞的吞噬活性、自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤活性、T、B淋巴细胞的增殖以及B淋巴细胞分泌IgG的水平。采用LC-MS代谢组学技术研究活性多糖调控巨噬细胞代谢的机制。动物水平活性测定包括测定环磷酰胺免疫抑制小鼠的白细胞水平、免疫器官指数、免疫细胞因子水平、T淋巴细胞亚群。研究结果:1、采用葡聚糖凝胶(Sephadex G-100)将注射用黄芪多糖分为不同分子量的两部分,分别命名为 APS-Ⅰ(>500 kDa)和 APS-Ⅱ(10 kDa)。2、对两部分不同分子量的多糖进行化学结构分析,结果表明:APS-Ⅰ含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸,其摩尔比接近1.5:1:5.4:0.08:0.1,糖苷键类型为D-Glcp-(1→,→4)-D-Glcp-(1→,→2)-L-Rhap—(1→,D-Araf(1→,→5)-D-Araf-(1→,→2,5)-D-Araf-(1→以及→4)-D-Galp-(1→。APS-Ⅱ含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸,其摩尔比为9:1:1.4:0.04:0.001,其糖苷键类型 主 要 为 α-D-Glcp-(1→,→4)-α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Glcp-(1→,→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→3,4,6)-α-D-Glcp-(1→,→2)-α-L-Rhap-(1→,α-D-Araf(1→,→5)-α-D-Araf-(1→以及 →4)-β-D-Galp-(1→。3、对两种多糖在细胞水平进行活性筛选,研究结果表明:APS-Ⅱ在促进巨噬细胞的吞噬活性及增强NK细胞杀伤活力方面效果优于注射用黄芪多糖和APS-Ⅰ组。APS-Ⅱ在促进T、B淋巴细胞增殖以及促进B淋巴细胞分泌IgG水平方面效果优于注射用黄芪多糖和APS-Ⅰ组。4、活性多糖APS-Ⅱ作用于巨噬细胞Raw 264.7后,细胞内外共发现41种差异代谢物,主要涉及氨基酸代谢、能量代谢及抗氧化作用。提示注射用黄芪多糖活性成分可能参与调控上述过程。5、对两种多糖在动物水平的活性验证实验表明:APS-Ⅱ可以提高环磷酰胺免疫抑制小鼠的白细胞水平和免疫器官指数,升高细胞因子IL-2、IL-6、GM-CSF水平,并能调节 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。结论:注射用黄芪多糖经分离纯化得到分子量>500 kDa和10 kDa的两种多糖。通过单糖组成分析、甲基化分析、IR以及NMR分析对其结构进行了解析。体外细胞实验分析表明APS-Ⅱ能提高机体固有免疫和适应性免疫作用,体内实验表明APS-Ⅱ能提高化疗后小鼠的白细胞水平,并能提高其免疫作用,且主要是通过氨基酸代谢、能量代谢与抗氧化作用对巨噬细胞的代谢进行调控。因此,APS-Ⅱ是注射用黄芪多糖的主要活性成分,有望成为新一代注射用黄芪多糖产品。