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研究背景及目的:近年来从亚洲到欧美爆发流行的H5N1型高致病性禽流感病毒除了导致数百亿只鸡死亡或被捕杀外,还在世界范围内引起人感染和死亡。高致病性禽流感病毒具有传播速度快,易感宿主复杂及重组突变率高等特点,使其具有突破物种传播屏障的趋势。一旦其获得人与人之间传播的能力,将导致下次流感大爆发。研究禽流感病毒的致病机制将为其防御与治疗提供实验依据。非结构蛋白NS1是禽流感病毒最主要的毒力因子之一,其单一位点氨基酸的改变就可使病毒株由低致病性转变成高致病性。NS1主要的致病机制是抑制I型干扰素IFN-α/β的产生,使病毒逃逸机体固有性免疫系统的监视,增强致病性。另外,NS1还可影响宿主前mRNA的转录后加工及mRNA的核输出,从而抑制包括I型IFN在内的宿主蛋白质的合成,降低了机体抗病毒免疫反应的能力。目前虽然对NS1的致病机制有了认识,但很多问题还不能用现有的结果来解释,表明NS1的致病机制还有待深入研究。鉴于NS1是一个多功能性蛋白,可能通过多种信号通路引起多种抗病毒因子的改变,我们用表达谱芯片筛选了稳定表达NS1细胞株的基因表达变化,发现NS1可下调IL-6、IL-8等多种细胞因子的表达。本项目深入研究了NS1对IL-6、IL-8的表达调控机制,以期为阐明NS1的致病机制提供更多试验依据。方法:利用Real-time PCR及ELISA分别在基因水平及蛋白水平验证NS1对IL-6、IL-8的抑制作用;利用携带IL-6及IL-8启动子的荧光素酶报告系统检测NS1对IL-6及IL-8的调控是否与NF-κB有关;利用带有NF-κB结合位点的荧光素酶报告系统检测NS1对NF-κB的活性调控;利用TNFα刺激转染有NS1的细胞,Western blot检测NS1对p50、p65总蛋白的影响;分别提取胞浆及胞核蛋白,Western blot检测NS1对p50、p65入核的影响。结果:1、NS1可下调IL-6、IL-8等细胞因子的表达。本室前期表达谱芯片结果表明NS1可下调IL-6、IL-8、COX-2、CCL-20、CXCL-5等多种细胞因子的表达。Real-time PCR进一步验证NS1可下调上述各因子的表达。相对于转染NS1的细胞,对照组IL-6高表达4.7倍,IL-8高表达10倍,COX-2高表达3.05倍。ELISA结果表明,TNFα刺激后,在A549及293T细胞中,NS1组IL-8的表达量分别是对照组的37.5%及50%;LPS刺激后,在Raw264.7及NIH3T3细胞中,NS1组IL-6的表达量分别是对照组的38.5%及40%。2、NS1对IL-6、IL-8的下调与NF-κB有关。分别将野生型IL-6、IL-8的启动子及NF-κB结合位点突变的IL-6、IL-8启动子构建到携带荧光素酶报告基因的表达载体上并转染细胞。结果显示在A549及293T细胞中,NS1可抑制带有野生型IL-6、IL-8启动子的荧光素酶表达,而对带有NF-κB结合位点突变的IL-6、IL-8启动子的荧光素酶则无抑制作用。表明NS1对IL-6、IL-8的表达下调与NF-κB有关。3、NS1能抑制NF-κB的活性。将NF-κB结合位点构建到携带荧光素酶报告基因的表达载体上并转染细胞。结果可见在A549、HepG2及293T细胞中,NS1组荧光素酶的表达分别只占对照组的18%、50%及30%。4、NS1不影响NF-κB的表达,但能抑制NF-κB从胞浆进入胞核。分别将pcDNA3.0及pcDNA3.0-NS1载体转染细胞后,给予TNFα刺激,Western blot检测发现NS1组与对照组p50、p65总蛋白的表达量没有改变;分别提取胞浆及胞核蛋白,Western blot检测发现NS1组胞核中p50、p65的蛋白量低于对照组。表明在TNFα刺激时, NS1可抑制NF-κB从胞浆转移到胞核,从而抑制了NF-κB的活性。结论:1、NS1蛋白可下调IL-6、IL-8的表达;2、NS1对IL-6、IL-8的下调与NF-κB有关;3、NS1不改变NF-κB的表达量,但能抑制NF-κB从胞浆转移到胞核。