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目的:1.制备人巨细胞病毒（human cytomegalic virus,HCMV）PP65抗原的单克隆抗体,建立HCMV PP65抗原的免疫组化检测方法2.制备HCMV PP65抗原的纳米抗体,并初步鉴定其与PP65抗原的反应性方法:1.诱导PQE30-PP65重组质粒表达PP65抗原,免疫BALB/c小鼠。通过血清抗体阳性小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）的细胞融合,HTS筛选,扩大培养,亲和纯化获得单克隆抗体。对制备的单克隆抗体亚型、效价及特异性进行测定,并将其用于临床样本的玻片免疫组化检测。2.为获得HCMV PP65特异性纳米抗体,本研究以重组PP65蛋白为靶抗原对已构建的非免疫性噬菌体文库进行四轮淘筛后,采用间接ELISA法筛选出8株PP65特异性纳米抗体序列,并将序列构建入pClod低温诱导原核表达载体,进行纳米抗体的重组表达和纯化。进行大量制备,采用间接ELISA法验证制备的纳米抗体与PP65抗原的反应性。结果:1.将PQE30-PP65重组质粒转化至E.coli M15感受态细胞中。加入IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定,实验组在26-33kDa附近可见明显条带,与预期大小一致,说明重组质粒转化成功并可以表达目的蛋白。2.通过western-blot鉴定,在26-33kDa附近可见一条与HRP标记的抗His单克隆抗体结合的清晰条带,说明该蛋白为目的蛋白且带有his标签,可用镍柱进行纯化。3.对PQE30-PP65重组质粒进行大量诱导表达,超声破碎菌体,利用镍柱亲和层析法对目的蛋白进行纯化,纯化后样品经12%SDS-PAGE结果显示,在26-33kDa附近可见明显的单一条带,与预期大小一致,表明成功制备纯度较高的PP65蛋白。4.以PP65蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,选择血清效价最高的小鼠再次加强免疫。取免疫后的小鼠脾细胞,制备杂交瘤细胞,经过阳性杂交瘤细胞筛选及3次亚克隆化后,共筛选出8株高滴度的抗HCMV PP65特异性的单克隆抗体细胞株。5.对8株单克隆抗体纯化后进行纯度鉴定,经12%的SDS-PAGE检测,发现均可在50kDa左右看到单抗的重链,在25kDa附近看到单抗的轻链,表明纯化的单抗纯度较高。6.使用单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒通过间接ELISA的方法鉴定抗体亚类,经鉴定,8株抗体的重链亚类均为IgG1型抗体,轻链均为κ链。7.通过间接ELISA法检测纯化后的8株单克隆抗体效价,确定8株单抗效价均达到1:1024000以上。8.将8株单克隆抗体分别与PP65蛋白及其他4种不同的无关蛋白进行酶联免疫吸附实验,检测其特异性,发现8株单抗与PP65蛋白反应的OD450-630值均明显高于其他无关蛋白。说明8株单抗均能很好的特异性识别PP65目的蛋白,而与其他蛋白的反应性较低,表现出良好的特异性。9.利用纯化后的8株单克隆抗体对临床已知的阳性及阴性标本进行免疫组化检测,证明其中6株单抗能够准确界定阳性及阴性感染。10.以PP65为筛选抗原,对非免疫文库进行四轮淘筛后筛选出8株抗原特异性的纳米抗体。11.将8株纳米抗体对应的基因序列插入pCold I原核表达载体,对8株纳米抗体进行表达鉴定。经SDS-PAGE和Werstern-blot鉴定,8株纳米抗体均与预期分子量大小一致,且能与HRP标记的小鼠抗His抗体结合,说明成功表达8株纳米抗体。12.将8株纳米抗体进行大量诱导表达,用镍柱亲和层析法进行纯化,用超滤离心管对目的蛋白进行缓冲体系置换和浓缩,对纯化后的样品进行SDS-PAGE鉴定,结果显示成功获得纯度较高的8株纳米抗体。13.通过间接ELISA的方法检测8株纳米抗体与PP65抗原的反应性。可见其中2株抗体与PP65抗原反应性较好。结论:1.制备了8株针对HCMV PP65抗原的单克隆抗体,其中6株能够通过玻片免疫组化准确鉴定HCMV激活性感染。研究结果为HCMV感染检测试剂盒的研发提供了材料。2.筛选并制备了2株针对HCMV PP65抗原的纳米抗体,为HCMV感染检测试剂的研发以及抗HCMV靶向药的载体研发提供了材料。