神经前体细胞 (NPCs) 存在于胚胎以及成年哺乳动物的中枢神经系统 (CNS)，是一群具有自我更新、自我增殖和多向分化潜能的细胞。近年来，有关NPCs的研究已成为神经生物学领域的研究热点，因为它既是研究神经系统发育和神经细胞分化的良好载体，又是治疗CNS损伤以及退行性疾病最理想的供体细胞来源之一。研究发现CNS的细胞外基质 (ECM) 在体内NPCs的分化和发育过程中发挥着相当重要的调节功能，近年来还有证据表明这种调节功能可以通过激活integrins信号通路来实现，其中还包括MAP激酶通路的参与。 硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs) 是CNS细胞外基质中的重要成分，在神经细胞的分化和发育过程中发挥极其重要的调控功能。它们在发育期时充当轴突生长的导向分子，限制轴突向不合适的方向延伸；成年后参与形成神经元周围网络来调节神经系统的可塑性；而在CNS损伤后，则作为胶质瘢痕中的重要成分，阻碍受损轴突的再生和残余神经元的代偿性生长。然而，目前对于CSPGs在NPCs发育过程中的表达以及相应的生理功能还知之甚少。 本文第一部分研究的主要目的是了解CSPGs对NPCs增殖、迁移和分化等生物学特性的影响及其可能的作用机制，为研究CSPGs在CNS中的生物学功能提供新的线索，同时也为NPCs移植用于神经系统退行性疾病及CNS损伤的临床治疗提供一些新的思路。 在研究中，首先运用双重免疫荧光染色证实来源于E16胚胎大鼠脑的NPCs组成性表达CSPGs；然后应用硫酸软骨素酶Chondroitinase ABC (Chase ABC)，选择性降解连接在CSPGs核心蛋白上的糖氨多糖链，破坏内源性CSPGs的功能，观察NPCs在增殖、迁移和分化等诸多生物学特性方面的变化，由此推测内源性CSPGs对NPCs生物学特性的影响。 结果发现： (1) 加入Chase ABC后，NPCs仍可分裂增殖，但细胞的粘附性增加，由悬浮成球生长转变为贴壁生长，形成不规则的细胞团块，一些细胞从神经球中向外迁移，其胞体上出现小而不规则的突起，呈现一定分化趋势，这些变化提示CSPGs对维持NPCs细胞球的形态有重要作用。 (2) [3H]同位素掺入实验证明一定浓度范围内的Chase ABC处理可以使NPCs呈现明显的剂量非依赖性[3H]掺入量增加，与对照组相比，增幅约为19-20％ (P<0.05)。而流式细胞术对细胞周期的分析结果显示Chase ABC处理除了引起G2-期细胞下降外 (P<0.05)，G1-期、S-期细胞以及扩增指数 (PI) 都没有明显差异。上述结果提示，Chase ABC处理不改变NPCs的细胞周期，但由于神经球立体构象和生长形态发生改变，使每个进入增殖周期的细胞都容易摄入同位素标记的核苷酸用于DNA合成，因而从整体水平上促进了NPCs的增殖。 (3) 应用免疫荧光染色和流式细胞术证明，在含有神经生长因子的增殖环境中，Chase ABC处理不影响NPCs特征性标志Nestin的表达，但增加了星型胶质细胞分化标志GFAP的表达，这一点与细胞形态上的分化趋势相吻合。这些结果提示，CSPGs不仅参与维持NPCs细胞球的形态，还有利于它们保持前体细胞的未分化状态。 (4) 神经球的迁移实验结果显示，在选定的3个时间点，Chase ABC处理明显促进了NPCs的迁移，表明CSPGs对NPCs的迁移有一定的限制作用。 (5) 在含有1％ FBS的分化环境中，通过免疫荧光染色和western blot分析，证明Chase ABC处理显著改变了NPCs的体外分化格局和分化细胞的形态，如：增加了β-III tubulin+神经元的分化比例，而且从单个神经元上延伸出的突起总长度更长，结构更复杂；GFAP+的星型胶质细胞比例明显降低，且多数为胞体呈星型，突起细长且具有高度分支结构的类似II型星型的胶质细胞；少突胶质细胞形态更趋成熟，而且成熟分化标志－髓鞘碱性蛋白 (MBP) 的表达量明显增加，这些结果表明CSPGs是NPCs分化的重要调控因素。 (6) 整合素integrins功能封闭实验证明，Echistatin (integrins功能抑制剂)可以阻断Chase ABC处理所引起的NPCs细胞球生长形态改变和少突胶质细胞更趋成熟的效应。这些结果表明integrins信号通路参与了CSPGs对NPCs生物学特性的调节。 哺乳动物的CNS中包含种类众多的CSPGs，它们在发育过程中具有独特而复杂的时空表达模式，Versican就是其中一类广泛存在于CNS中的大分子CSPGs，它最早是从人的成纤维细胞和发育中的鸡胚肢芽中分离得到，后来又发现在正常CNS以及大脑肿瘤中都有表达。Versican具有高度的反应活性，在发育和疾病的众多关键环节发挥重要功能。结构上，它由N-端的G1区、硫酸软骨素 (CS) 结合区以及C-端G3区这三大部分组成，其CS结合区由2个外显子编码，经mRNA水平剪接，Versican可产生4种异构体，其中 V0包含CSα和CSβ区，V1和V2分别具有CSβ区或CSα区，V3则两者都不具备。在大脑发育过程中，VersicanV1/V0和V2具有互补的表达模式，前者主要见于胚胎发育的晚期阶段，后者则多见于成熟大脑中，这种迥异的表达格局可能反映了它们在体内生理功能的差异。 此外，体内细胞外基质的组成并不是一成不变的，诸多生理和病理过程都会影响它们的构成和功能，而细胞因子就是其中一种重要的调控因素，如转化生长因子(TGF-β)、白介素-1β (IL-1β) 以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 等。研究发现成年的CNS损伤后，大量细胞因子被释放到损伤局部，促进了反应性胶质增生和胶质瘢痕的形成，限制了轴突的再生。文献报道CNS损伤后，Versican的表达上调，而且主要分布于抑制轴突再生的微环境中，但目前研究人员并不完全清楚损伤或者致炎因子究竟是如何对功能各异的Versican异构体的表达进行调控的。 本文第二部分研究的主要目的就是观察Versican及其异构体在NPCs及其分化过程中的表达规律以及炎症因子对Versican基因表达的调控。 研究发现： (1) 免疫荧光双重染色结果显示，Versican在Nestin+的NPCs及其分化的GFAP+的星型胶质细胞、βIII-tubulin+的神经元和Rip+的少突胶质细胞 (Ols)中都有组成性表达。 (2) 建立了一种定向诱导NPCs分化为少突胶质前体细胞 (OPCs)，并使其进一步分化为成熟少突胶质细胞的体外培养模型，该模型能模拟体内少突胶质细胞的发育分化过程。结果发现，从OPCs到成熟Ols的体外分化过程中，早期分化标志A2B5的表达迅速减少，而一些更加成熟的分化标志，如O4, O1 以及MBP的表达则逐渐增加。 (3) 通过免疫荧光双重染色观察Versican在少突胶质细胞各分化阶段的表达情况。结果发现在A2B5+的OPCs、O4+的前少突胶质细胞、 O1+的未成熟少突胶质细胞以及MBP+的成熟少突胶质细胞的胞体和突起表面都有Versican的表达。 (4) 通过RT-PCR从mRNA水平比较了Versican V1/V0以及V2在NPCs以及Ols的3个不同分化阶段（OPCs、分化4天、分化14天）的表达格局，结果发现：Versican V1/V0在NPCs中表达最低 (P<0.01)，至OPCs时表达上调至原先的1.42倍，并在随后的分化中维持较高的表达水平；Versican V2在NPCs中表达也较低，其峰值出现在OPCs阶段，表达量约为NPCs时的2.13倍 (P<0.01)，然后就逐渐下降，至分化14天时已接近NPCs 的表达水平 (P>0.05)。 (5) 建立Real-time PCR检测体系，从mRNA水平半定量观察两种炎症因子—肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和γ-干扰素 (IFN-γ) 对NPCs中Versican不同异构体基因表达的影响，结果显示：TNF-α和IFN-γ单独或者合并使用，不影响NPCs中Versican V1/V0的表达，但以剂量依赖的方式上调了VersicanV2的表达，二者的合并作用对Versican V2的表达调节还具有一定累加效应。 结论： (1) CSPGs参与了对NPCs增殖、迁移、分化等众多生物学特性的调控，其作用机制涉及integrins信号转导通路的参与。 (2) Versican广泛表达于多种神经细胞，包括NPCs、神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。不同Versican异构体（V1/V0、V2）在NPCs向少突胶质细胞分化的不同阶段，显示不同的表达格局。炎症因子参与Versican基因表达的调控，TNF-α和IFN-γ不影响NPCs中V1/V0的表达，但明显上调V2的表达。