背景:肾脏为高灌注器官，非常容易发生缺血再灌注(ischemia／reperfusion，I／R)损伤。临床上因I／R损伤导致的急性肾功能衰竭十分常见。既往的研究认为肾脏缺血再灌注损伤中的肾小管上皮细胞死亡主要是细胞坏死。然而近年来研究证实肾小管细胞凋亡在肾脏缺血再灌注时的细胞死亡中起重要作用而且可能是引起肾功能衰竭的重要机制。目前缺血再灌注损伤中肾小管上皮细胞凋亡的具体机制仍不清楚。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶中的一个亚类，通常在机体受到各种应激刺激时被激活，介导细胞的生长、分化、增殖、死亡等生物学反应。目前有文献报道p38信号通路的激活是肾缺血再灌注后细胞凋亡的发生机制之一。以往的研究证实p38MAPK的激活在无创肾动脉夹闭45min所致肾缺血再灌注损伤的发生中具有明显的促细胞凋亡作用，但p38MAPK的激活是否也介导了模拟缺血再灌注损伤中离体培养的肾小管上皮细胞凋亡，目前国内尚未见报道。本课题采用离体纯化培养的SD大鼠肾小管上皮细胞建立模拟缺血再灌注损伤模型，观察在该损伤过程中肾小管上皮细胞的凋亡现象以及p38MAPK的抑制剂-SB203580对模拟缺血再灌注损伤诱导SD大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响，以期为临床治疗肾缺血再灌注损伤提供理论依据。 目的: 1．观察模拟缺血再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用，探讨两者间的关系。 2．观察p38MAPK在模拟缺血再灌注损伤后的活性变化及p38MAPK的抑制剂-SB203580对凋亡的影响，探讨p38信号通路在模拟缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡中的作用。 方法: 1．模拟缺血模型建立及模拟缺血再灌注损伤与肾小管上皮细胞凋亡的关系：采用胶原酶消化法、Percoll密度梯度离心法、差速贴壁法分离、纯化培养肾小管上皮细胞。分离的肾小管节段培养于DMEM/F12中。cytokeratin18免疫细胞化学法及透射电镜鉴定肾小管上皮细胞；以缺氧(5％CO<,2>、1％O<,2、94％N<,2>)+无糖KR液模拟缺血、复氧复糖模拟再灌注诱导肾小管上皮细胞凋亡，用Hoechst33258染色法、流式细胞仪法观察正常对照组及模型损伤组于模拟缺血1h复灌6、12、24、48h细胞凋亡的情况及变化规律。 2．p38信号通路在模拟缺血再灌注后肾小管上皮细胞凋亡中的作用：在进行模拟缺血再灌注损伤前1h，应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580，然后按照模型组进行细胞损伤，选择模拟缺血1h复灌后24h时，用流式细胞仪及TUNNEL染色法检测不同剂量(0.2、2、20umol·L<-1>)p38MAPK的抑制剂SB203580对肾小管上皮细胞凋亡的影响。用Western blot法检测模拟缺血1h复灌30min后正常对照组、模型损伤组及SB用药组(0.2、2、20μmol·L<,-1>)p38MAPK的蛋白表达、激活及SB203580对磷酸化p38MAPK的抑制情况。 结果: 1．肾小管上皮细胞原代培养及传代：倒置显微镜下观察，原代分离的肾小管节段12～24h贴壁；24h后有少量上皮样细胞从肾小管节段周边爬出；72～96h后见细胞呈指数样生长；120h后细胞已基本能达到融合，镜下观察可见细胞体积较大，细胞间紧密相连融合成片及呈复层生长，核较大呈椭圆形，多见有2～3个核仁，呈多边鹅卵石铺路样。传代后的细胞生长迅速，约3～5日后可传第2代，传3代后细胞生长渐渐缓慢，往往不能进一步传下去。cytokerainl8免疫细胞化学法及透射电镜鉴定肾小管上皮细胞纯度达97％～98％，证明本研究中肾小管上皮细胞的分离、纯化及体外培养成功可行。 2．I/R损伤模型建立及模拟I/R损伤与肾小管上皮细胞凋亡的关系：模拟缺血1h复灌12h时倒置显微镜下观察到了肾小管上皮细胞的形态学变化、Hoechst染色法观察到细胞凋亡核的变化，流式细胞仪分析细胞再灌注6、12、24、48h的凋亡率分别达(7.5±1.1)％、(10.9±2.5)％、(16.0±1.9)％、(22.3±4.9)％，与正常对照组相比均有显著性差异。相关分析表明，模拟缺血再灌注损伤所诱导的肾小管上皮细胞凋亡率的增加与再灌注时间的延长具有显著正相关(r=0.922，p<0.01)。 3．p38信号通路在模拟缺血再灌注后肾小管上皮细胞凋亡中的作用：(1)模拟缺血1h复灌24h时应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580(0.2、2、20μmo1-L<-1>)，经流式细胞仪检测三个不同剂量组均可降低再灌注24h的肾小管上皮细胞凋亡百分率(三个剂量组的凋亡率分别为14.6±2.2％、13.2±1.3％、9.2±1.3％)，以20μmol-L<-1>组效果最好(p次之(p<0.05)，0.2μmol-L<-1>组与模型组相比尽管细胞凋亡率有所下降，但无显著性差异(p>0.05)。进一步用TUNNEL染色法也验证了流式细胞仪的检测结果。实验结果表明：在一定范围内，随着SB203580剂量的增加，凋亡细胞百分率渐呈下降，SB203580似呈浓度依赖性抑制细胞凋亡。(2)模拟缺血1h复灌30min时用Western blot法检测正常对照组、模型损伤组及SB不同剂量预处理组p38MAPK的表达、激活情况：Western blot结果显示，在肾小管上皮细胞模拟缺血1h复灌30min后，细胞内的磷酸化p38MAPK活性明显增高，与正常对照组相比具有显著性差异(p<0.01)，在模拟缺血前应用不同剂量的SB203580预处理细胞，均可不同程度的降低模拟缺血再灌注损伤引起的细胞内p38MAPK磷酸化灰度值。其中，与I/R组相比，应用中、大剂量组的SB203580可显著性降低p-p38MAPK的灰度值(p<0.01)，小剂量组则无统计学意义(p>0.05)。而各组细胞内的总的p38MAPK水平不变。 结论: 1．采用胶原酶消化、Percoll密度梯度离心法成功地进行了SD大鼠肾小管上皮细胞体外培养并传3代。建立了物理方法的模拟缺血再灌注细胞损伤模型，并经Hoechst核染色、流式细胞仪凋亡率分析、TUNNEL法证实体外培养的肾小管上皮细胞在经历模拟缺血再灌注损伤后可诱导细胞凋亡，且凋亡的发生随再灌注时间的延长而加重，具有显著的时间相关性。 2.模拟缺血再灌注时肾小管上皮细胞内的p38MAPK可被激活，p38MAPK的早期激活可能是导致后期细胞凋亡的触发因素，应用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580可显著降低模拟缺血再灌注后细胞内早期的p38MAPK磷酸化及改善后期的细胞凋亡水平。