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花生(ArachishypogaeaL.)是世界范围内广泛栽培的油料和经济作物,也是我国单产、总产和出口创汇额最高的油料作物,高产稳产是我国花生育种的主要目标之一。
花生栽培种遗传基础狭窄,通过常规育种方法,不但耗时耗力,而且难度极大,往往导致育种周期长而且效率不高的问题。番茄中发现的FW2.2基因是影响果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究从花生中克隆得到了FW2.2的同源基因,通过农杆菌介导法和花粉管通道法在花生中进行了遗传转化研究,旨在为培育高产花生新种质奠定基础。
本试验以番茄FW2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物进行扩增。从栽培种鲁花11号乖鲁花12号中克隆得到了728bp和727bp的片段,从野生种A.stenosperma中克隆得到722bp的基因片段。通过RT-PCR克隆均得到579bp的基因片段。通过DNA和cDNA测序结果比对分析,确定花生FW2.2同源基因中含有两个内含子,编码区555bp,编码184个氨基酸。利用生物信息学软件,将花生FW2.2同源基因编码的氨基酸序列与其它物种进行比对,一致性为34.78%-66.85%。
利用克隆得到的FW2.2cDNA全长序列,构建了植物表达载体pCAMBIA23A-FW2.2和反义表达载体pROKⅡ-FW2.2。
将植物表达载体pCAMBIA23A-FW2.2转化花生,采用PCR方法对抗性植株进行了鉴定。结果表明:通过农杆菌介导法,在花育22号和花育23号两个品种中分别获得28个和13个阳性的独立转化子,将鉴定为阳性的植株嫁接法驯化移栽大田。花粉管注射法从鲁花11号中鉴定出163株阳性苗,阳性率为80.30%。
半定量RT-PCR显示FW2.2基因在野生种和栽培种中的表达存在差异。该基因在野生种表达量高于栽培种;在花生的不同部位均可表达,但在幼胚中的表达量高于叶片和花。
本研究结果为分析和研究FW2.2基因的功能及其调控机理奠定了基础。