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第一部分AdBMP9和AdGFP的扩增及心肌前体细胞的感染目的:通过293细胞扩增得到高滴度的腺病毒,用AdBMP9重组腺病毒感染心肌前体干细胞使之高表达BMP9。方法:培养并利用293细胞对低滴度的AdBMP9和AdGFP腺病毒进行反复扩增后收集得到高滴度腺病毒。当心肌前体干细胞传代贴壁至70%~80%时,在5 ml完全培养基中加入20μL扩增后的腺病毒感染心肌前体干细胞6～8小时后换液,24小时后荧光倒置显微镜观察绿色荧光表达并用流式细胞仪检测细胞感染效率,RT-PCR技术检测被感染的心肌前体干细胞BMP9的表达量。结果:1.病毒原液经293细胞反复扩增后,获得了高滴度的AdBMP9和AdGFP。2.高滴度的AdBMP9和AdGFP分别感染心肌前体干细胞24小时后,流式细胞仪检测荧光表达效率分别为46%和45%。3.RT-PCR结果显示AdBMP9感染的心肌前体干细胞BMP9的表达量明显增高(P<0.05),而AdGFP感染的心肌前体干细胞中BMP9的表达量跟心肌前体干细胞本身相比并无明显的差异(P>0.05)。结论:利用293细胞扩增可以得到高滴度的腺病毒;高滴度的腺病毒对心肌前体干细胞有较高的感染率;AdBMP9感染心肌前体干细胞后BMP9的表达量明显增高。第二部分BMP9对心肌前体干细胞改善心梗大鼠心功能作用的研究目的:探讨BMP9能否促进心肌前体干细胞改善心梗大鼠心功能。方法:26只雄性SD大鼠随机分成三组(1)MI组(n=10);(2)MI+GFP组(n=8);(3)MI+BMP9组(n=8)。动脉圆锥下结扎冠状动脉左前降支10~15min后,在梗死心肌组织周围即时多点注入生理盐水混匀的腺病毒感染的心肌前体干细胞悬液(100μL,5～6×106个/mL)。细胞植入四周后,利用超声心动图检测左室心功能参数,Masson染色计算心脏梗死面积及观察植入细胞形态学和免疫荧光检测α-MHC及α-actin蛋白的表达。结果:1.动脉圆锥下结扎大鼠冠状动脉的左前降支后,成功建立心梗模型。术后4周形态学显示,心肌梗死部位心肌细胞稀少,胞浆稀薄,有大量的纤维组织及炎症细胞,且左心室壁明显变薄。2.超声心动图结果显示细胞植入4周时,MI+BMP9组LVESD较MI组降低而FS则升高,均有显著性差异(P﹤0.05 , P﹤0.01);且MI+ BMP9组与MI+GFP组比较,改善更为明显(P﹤0.05)。3.MI组大鼠心肌梗死面积的百分比为39.7%±2%(n=8),MI+GFP组的心梗面积百分比为37.3%±3%(n=6),MI+BMP9组的心梗面积百分比为34.6%±3%(n=7)。MI+GFP组同MI组比较(P﹤0.05),MI+BMP9组同MI组比较(P﹤0.01)且MI+BMP9组同MI+GFP组相比P﹤0.05)。4.植入细胞4周后,形态学检查发现植入的细胞离正常心肌组织越接近,细胞胞浆越饱满,而在注入细胞团块中央的细胞胞浆稀少。免疫荧光结果显示,高表达BMP9的心肌前体干细胞和GFP标记的心肌前体细胞均有a-MHC和a-actin的表达。通过测量分析各组目的蛋白荧光的吸光度值发现,MI+BMP9组中植入细胞的a-MHC和a-actin表达量较周围的正常组织弱(P﹤0.05),但较MI+GFP组中植入细胞的表达较高(P﹤0.05)。结论: BMP9可以促进心肌前体干细胞分化表达心肌特异性结构蛋白,并增强心梗大鼠的左室心功能。