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研究目的:本研究一方面应用16s rRNA高通量测序技术寻找不同中医证型的慢性再生障碍性贫血（chronic aplastic anemia,CAA）患者及健康人群肠道菌群分布特征;另一方面,通过非靶向的气相色谱质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）代谢组学方法分析其有意义的潜在代谢物标志及代谢通路,进一步探讨慢性再生障碍性贫血发病相关的微生态失调状况及不同中医证型的物质基础,为中医证型客观化研究提供依据。研究方法:本研究21例CAA组样本均来源于2018年7月至2021年6月江苏省中医院血液科门诊和病房的慢性再生障碍性贫血患者,其中肾阴虚型12例,肾阳虚型4例,肾阴阳两虚型5例;正常对照组24例来自江苏省中医院体检中心的健康体检者。通过16s rRNA高通量测序技术及GC-MS代谢组学技术进行粪便标本的高通量测序及代谢组学检测。本研究第二部分为慢性再生障碍性贫血患者的肠道菌群丰度与多样性研究,采用16s rRNA高通量测序技术检测标本,观察正常组与不同中医证型CAA患者的菌群丰度与多样性,寻找慢性再生障碍性贫血发病相关的微生态失调情况及潜在的生物学标志,探讨不同中医证型间的微生态差异。本研究第三部分为慢性再生障碍性贫血患者粪便代谢组学研究,对所有样本进行GC-MS代谢组学分析,经MS-DIAL软件进行预处理后得到包括样品信息、保留时间、各物质峰的名称、质谱响应强度（峰面积）和质核比等在内的三维矩阵,对其进行偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant ananlysis,PLS-DA）及正交偏最小二乘法分析（orthogonal partial least squares discriminant ananlysis,OPLS-DA）来区分各组间代谢轮廓的总体差异,使用t检验、ANOVA检验来验证组间代谢物是否具有显著性差异。随后采用基于KEGG（https://www.kegg.jp/）数据库富集分析差异代谢物代谢通路,利用二级质谱数据将筛选得到的差异代谢物在HMDB数据库中进行比对和结构确证,再基于KEGG数据库进行代谢通路分析匹配,进一步筛选得到可以代表CAA及不同肾虚证型的代谢组学标志和代谢通路。研究结果:1.采用16s rRNA高通量测序技术对CAA患者与健康人群粪便的菌群组成分析发现,从门纲目科属种不同物种层面水平分析,CAA患者均存在与正常人显著不同的肠道菌群群落,Alpha多样性分析示:慢性再生障碍性患者chao指数、observed species指数均明显低于正常组（P＜0.05）。微生物多元变量统计分析提示与正常组相比,慢性再生障碍性贫血患者相对丰度较高的肠道菌群包括:普雷沃菌属（Prevotel la）,普雷沃菌科（Prevotellaceae）,放线菌门（Actinobacteriota）,双歧杆菌属（Bifidobacterium）,双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）,双歧杆菌目（Bifidobacteriales）,放线菌纲（Actinobacteria）,鼠杆菌科（Muribaculaceae）,鼠杆菌属（Muribaculaceae）,巴恩斯氏菌属（Barnesiella）,光岗菌属（Mitsuokella）,红蝽杆菌目（Coriobacteriales）,红蝽杆菌纲（Coriobacteriia）,红蝽杆菌科（Coriobacteriaceae）,柯林斯菌属（Collinsella）,异普氏菌属（Alloprevotella）,巴斯德菌目（Pasteurellales）,巴斯德菌科（Pasteurellaceae）。2.采用16s rRNA高通量测序技术对不同中医证型CAA患者粪便的菌群组成分析发现,不同证型CAA患者肠道菌群多样性存在差异,其中肾阴阳两虚型菌群多样性明显低于肾阴虚型,肾阴虚型菌群多样性明显低于肾阳虚型。在门纲目科属种水平,肾阴阳两虚型组相对丰度较高的肠道菌群为光岗菌属,肾阴虚型组相对丰度较高的肠道菌群为霍尔德曼氏菌属（Holdemania）,而肾阳虚型组相对丰度较高的肠道菌群包括:高氏瘤胃球菌属（[Ruminococcus]gauvreauiigroup）,红杆菌目（Rhodobacterales）,红杆菌科（Rhodobacteraceae）,普雷沃菌属 UCG-001（PrevotellaceaeUCG-001）。3.运用GC-MS方法分析CAA患者粪便非靶向代谢组学变化,研究表明与正常人相比,CAA患者存在38种差异性粪便代谢物,其中3-羟基苯乙酸、腺嘌呤、腺苷-5’-一磷酸、α-酮戊二酸、β-谷甾醇、细胞分裂素、脱氧鸟苷酸、双半乳糖醛酸、二羟基丙酮、龙胆酸、甘油酸、鸟嘌呤、高丝氨酸、异柠檬酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-犬尿氨酸、甘露糖6-磷酸、N-乙酰谷氨酸、邻磷酸乙醇胺、邻苯二甲酸、奎宁酸、丝氨酸、酪醇、Udp-葡萄糖醛酸、尿酸的相对含量在CAA中呈现上调趋势,3’-腺苷酸、花生酸、山葵酸、D-核糖、对苯二酚、肌苷、N-乙酰鸟氨酸、去甲肾上腺素、哌啶酸、吡咯-2-羧酸、四氨基甲酸呈现下调趋势。这些代谢物主要为核糖核苷有机氧化合物、羧酸及其衍生物、3’-磷酸、脂肪酰基、吡咯、咪唑嘧啶、嘌呤核苷酸、酚类、嘌呤核苷、酮酸及其衍生物、类固醇和类固醇衍生物、二氮杂苯、苯和取代衍生物、有机磷酸及其衍生物、内酯。生物信息学分析提示这些差异代谢物富集的主要代谢通路包括:精氨酸生物合成、嘌呤代谢、天冬氨酸和谷氨酸代谢、FoxO信号通路、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、丙氨酸、近端小管碳酸氢盐回收、乙醛酸和二羧酸代谢、GABA能突触、酪氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、味觉传导、氨基酰-tRNA生物合成、谷氨酸能突触、蛋白质消化吸收。4.运用GC-MS方法分析不同中医证型CAA患者粪便非靶向代谢组学提示:16种代谢物在CAA不同中医证型之间有明显差异,包括:5-甲氧基色胺、肾上腺素、熊果苷、β-丙氨酸、戊二胺、鹅去氧胆酸、胆酸、D-肌醇4-磷酸、羊毛甾醇、肌醇、N-乙酰-D-甘露糖胺、N-乙酰腐胺、植物鞘氨醇、丙酮酸、二十四烷酸、酪胺。这些代谢物主要为:吲哚及其衍生物、酚类、有机氧化合物、羧酸及其衍生物、有机氮化合物、类固醇和类固醇衍生物、丙烯醇脂质、羧肟酸及其衍生物、酮酸及其衍生物、脂肪酰基、苯和取代衍生物。它们富集的主要代谢通路包括:神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统、泛酸和辅酶A生物合成、糖酵解/糖异生、初级胆汁酸生物合成、磷酸肌醇代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导。研究结论:1.慢性再生障碍性贫血患者存在与正常人显著不同的肠道菌群结构,其菌群多样性减低,普雷沃菌丰度增加,毛螺旋菌丰度降低,这可能与CAATreg/Th17失衡所介导的免疫失调密切相关,进而导致造血衰竭。2.本研究发现不同中医证型CAA患者肠道菌群亦存在多样性差异,其中肾阴虚型菌群多样性明显低于肾阳虚型,并且肾阳虚型中有益菌种类和数量高于肾阴虚型。从物质层面验证了中医髓劳“阳虚易治,阴虚难调”的原因。3.与正常人相比,CAA患者存在差异性粪便代谢物谱,38种代谢物被筛选鉴定,其富集的主要代谢通路包括:精氨酸生物合成、嘌呤代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、GABA能突触、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、近端小管碳酸氢盐回收、FoxO信号通路、酪氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、味觉传导、氨基酰-tRNA生物合成、谷氨酸能突触、蛋白质消化吸收。这可能是CAA肠道菌群结构改变介导的免疫失调、造血衰竭引起的代谢变化,可为明确再障的分子发病机制及发现新的治疗靶点提供依据。4.本研究筛选鉴定出16种代谢物在CAA不同中医证型之间有明显差异,其富集的主要代谢通路包括:神经活性配体-受体相互作用、酪氨酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统、泛酸和辅酶A生物合成、糖酵解/糖异生、初级胆汁酸生物合成、磷酸肌醇代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导。从肠道微生态失调及粪便代谢组学角度分析CAA不同肾虚证型的物质基础,为中医微观辨证、中医证候客观化现代化研究提供新思路。