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目的靶向性治疗是一种潜在的有效抗白血病治疗方法,尤其在清除微小残留病、防止肿瘤复发方面发挥重要作用。本文将CD10单克隆抗体(anti-CD10 MAb)与胞壁酰二肽(MDP)连接合成新的免疫偶联物(MDP-Ab),观察免疫偶联物中MAb及MDP各自的生物活性。方法(1)MDP-Ab制备：采用化学合成方法将CD10单克隆抗体(anti-CD10 MAb)与胞壁酰二肽(MDP)连接合成新的免疫偶联物(MDP-Ab),硅胶柱及Sephacryl S-100凝胶柱分离纯化合成过程产生的各产物(PDP-arm-Boc、PDP-arm、PDP-MDP、IT-Ab及MDP-Ab);氢离子质谱仪、电喷雾电离质谱仪与紫外分光光度计分析合成中各产物的分子量(结果表达方式为MW+[H])及MDP-Ab中各分子比。以半胱氨酸标准曲线为准,采用Ellman’s试剂分析IT-Ab中巯基数量；(2)MDP-Ab中抗体活性检测：分离收集CDl0+急性淋巴细胞性白血病细胞(阳性率≥95%),加入MDP-Ab共同孵育,采用间接流式细胞术检测MDP-Ab与CD10+细胞结合能力,以未偶联的抗CD10抗体作对照。(3) MDP-Ab中MDP活性检测：采用Ficoll-Hypaque法分离急性淋巴细胞性白血病患儿外周血单个核细胞,贴壁3h,悬浮细胞经尼龙膜柱筛选获得T淋巴细胞,冻存备用。取贴壁细胞分为6组,分别为：对照组(rhGM-CSF+rhIL-4)、未偶联的抗CD10抗体组(rhGM-CSF+rhIL-4+anti-CD10)、未偶联的MDP组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP)、MDP-Ab组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab)、脂多糖(LPS)组(rhGM-CSF+rhIL-4+LPS)及MDP-Ab+LPS组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab+LPS),培养8天,收集各组树突状细胞(DC),检测细胞免疫表型、内吞作用及细胞上清液中白介素12(IL-12)水平。将丝裂霉素C处理过的DC与急性淋巴细胞性白血病患儿同体的淋巴细胞按1：10比例混合培养72h,CFSE染色法检测各组淋巴细胞增殖情况,ELISA方法检测上清液IFN-Y水平。结果(1)氢离子质谱显示PDP-arm-Boc、PDP-arm、PDP-MDP的分子量结果(MW+[H])分别为372.1,272.1,746.4;根据半胱氨酸标准曲线,显示IT-Ab中巯基数量为4.5；电喷雾电离质谱与紫外线吸光度结果显示免疫偶联物中MDP-Ab分子量约为101KD,其中MDP与Ab分子比为2：1。(2)间接流式细胞术结果示MDP-Ab结合CD10抗原的阳性率为94.69%,与未偶联的抗CD10抗体相比,无显著性差异(p>0.05)。(3)DC细胞免疫表型：MDP-Ab促进白血病患儿外周血DC表达HLA-DR、共刺激分子(CD80、CD86)及成熟分子(CD83)的阳性细胞均明显高于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组,但低于LPS组及MDP-Ab+LPS组(F=629.619,p=0.000)；(4)IL-12水平：对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组分别为(42.37±5.83)pg/ml,(54.41±4.35)pg/ml,(60.75±5.06)pg/ml,而MDP-Ab组(80.63±3.73)pg/ml,LPS组(160.15±11.43)pg/ml,MDP-Ab+LPS组(190.33±6.61)pg/ml,明显高于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组(F=857.872,p=0.000)。MDP-Ab组与LPS组、MDP-Ab+LPS组相比,亦有显著性差异(p<0.05)；(5)DC吞噬功能：对照组(即未成熟DC)为(81.3±10.1)%,而未偶联的抗CD10抗体组、未偶联的MDP组、MDP-Ab组、LPS及MDP-Ab+LPS组分别为(66.7±9.78)%,(62.5±6.72)%,(41.6±5.67)%,(33.9±3.42)%,(25.6±3.68)%,与对照组相比,有显著性统计学意义(F=383.04,p=0.000)。(6)混合淋巴细胞反应：与对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组相比,MDP-Ab组、LPS组及MDP-Ab+LPS组阳性细胞明显增高,以MDP-Ab+LPS组为最高(F=393.36,p=0.000);(7)IFN-Y水平：对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组分别为(67.72±3.94)pg/ml、(84.65±4.41)pg/ml、(89.69±3.02)pg/ml,而MDP-Ab组为(173.06±8.14)pg/ml,LPS组为(209.24±9.43)pg/ml,MDP-Ab+LPS组为(356.17±9.48)pg/ml。MDP-Ab组明显高于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组,而低于LPS组及MDP-Ab+LPS组(F=2497.18,p=0.000),且以MDP-Ab+LPS组水平最高。结论1、成功采用化学方法合成新免疫偶联物MDP-Ab2、MDP-Ab保持抗体特异结合抗原的活性,提示MDP-Ab具有靶向结合CD10+细胞能力。3、MDP-Ab能促进白血病患儿外周血树突状细胞表达高水平HLA-DR、共刺激分子(CD80/CD86)及CD83,分泌高水平IL-12,与细胞因子、脂多糖联合作用最强。4、MDP-Ab诱导的树突状细胞能促进同体淋巴细胞增殖,分泌高水平IFN-Y分子,与细胞因子、脂多糖联合作用最强,提示MDP-Ab保持促进树突状细胞增殖及成熟活性。目的探讨胞壁酰二肽-抗CD10偶联物激活淋巴细胞的功能及其对裸鼠白血病移植瘤的杀伤作用。方法采用Ficoll-Hypaque法分离急性淋巴细胞性白血病(ALL)患儿外周血单个核细胞,贴壁3h,取贴壁细胞分为6组,分别为：对照组(rhGM-CSF+rhIL-4)、未偶联的抗CD10抗体组(rhGM-CSF+rhIL-4+anti-CD10)、未偶联的MDP组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP)、MDP-Ab组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab)、LPS组(rhGM-CSF+rhIL-4+LPS)及MDP-Ab+LPS组(rhGM-CSF+rhIL-4+MDP-Ab+LPS)。采用反复冻融方法制备Nalm-6白血病细胞抗原,于DC诱导培养第4天加入且共同培养,隔日换液,继续培养。第8天,收集各组DC。经Nalm-6抗原致敏、丝裂霉素C处理过的DC与培养第7天的ALL患儿同体T淋巴细胞按1：10比例混合培养48h,加入Nalm-6细胞(效应细胞：靶细胞=10：1)共培育12h,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各组T淋巴细胞的杀伤活性。将36只4周龄的雄性BALB/C裸鼠皮下接种1×107个/0.2毫升Nalm-6白血病细胞,第7-10天可形成皮下结节的白血病裸鼠模型,随机分为6组(每组6只),移植瘤内分别接种上述各组淋巴细胞,每周1次,共2次,于给药第14天处死裸鼠。观察各组肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤体积变化率；HE染色观察肿瘤、肝脾组织变化。结果(1)T淋巴细胞杀伤活性：MDP-Ab组杀伤率为(35.66±5.81)%,明显高于对照组(7.29±2.42)%、未偶联的抗CD10抗体组(13.83±2.90)%及未偶联的MDP组(15.16±3.10)%,而低于LPS组(51.33±6.41)%及MDP-Ab+LPS组(63.33±6.92)%,以MDP-Ab+LPS组杀伤活性最强；(2)移植瘤生长：裸鼠皮下成瘤率可达100%,给药前,所有裸鼠肿瘤体积无显著性差异；给药后,MDP-Ab组肿瘤体积大小均明显小于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组,但大于LPS组及MDP-Ab+LPS组,且以MDP-Ab+LPS组体积变化最小；(3)各组肿瘤体积变化率：对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组第14天肿瘤体积变化分别为147.75,114.90,117.36,而MDP-Ab组为47.66,LPS组为32.31及MDP-Ab+LPS组为12.43,明显低于对照组、未偶联的抗CD10抗体组及未偶联的MDP组；(4)肿瘤肉眼及镜下形态学变化：肿瘤早期表现为皮下瘤节,呈圆形或椭圆形,后期表面凹凸不平呈多个结节融合,对照组3只裸鼠出现肿瘤非药物注射部分破溃,甚至糜烂。剥离瘤体时,与皮下组织分界比较清楚,粘连较少,质地坚硬,瘤体剖面血管丰富；光学显微镜下观察,对照组肿瘤细胞大小不一,排列紊乱,以多角形或圆形多见,排列紊乱,多见分裂相；而MDP-Ab组、LPS组及MDP-Ab+LPS组显微镜下可见不同程度的核固缩、碎裂及溶解、胞浆空泡现象,以MDP-Ab+LPS组最明显。。所有组裸鼠的肝脾均未见Nalm-6细胞浸润。结论1、MDP-抗CD10偶联物诱导的致敏DC体外能提高同体T淋巴细胞的杀伤活性,与LPS共同作用时效应最强。2、MDP-抗CD10偶联物诱导的致敏DC能促进同体T淋巴细胞发挥体内抑制肿瘤生长作用,且与LPS具有协同作用。3、成功建立Nalm-6白血病裸鼠模型,无全身转移情况。