论文部分内容阅读
microRNA是一种22～24nt的非编码RNA,能在转录后水平调控基因的表达,与疾病的发生发展及病理过程密切相关。前期实验已经发现急性缺血后会引起缺血脑组织中microRNAs的差异性表达,其中miR-140水平显著升高,其转录的激活机制尚不清晰。应激颗粒(Stressgranule,SG)是细胞为了适应外部环境刺激和变化而产生的一种保护机制,急性脑缺血会引起大鼠脑组织应激颗粒形成,脑组织的恢复与其应激时生成应激颗粒的形成密切相关,而应激颗粒的形成依赖于多种RNA结合蛋白对RNA的结合从而聚集。左旋樟脑是临床常用中药醒脑静的有效小分子化合物,前期研究发现其对MCAO模型大鼠脑损伤具有保护作用,但其对microRNA-RNA结合蛋白的调控以及应激颗粒形成的调控机制仍然不明确。因此提出“左旋樟脑作用于miR-140-HnrnpA1调控急性缺血诱导的应激颗粒形成”假说。本研究通过建立无血清刺激PC12细胞模型及MCAO动物模型,探索microRNA-HnrnpA1轴对应激颗粒形成的作用及左旋樟脑干预的分子机制。1.miR-140-HnrnpA1轴抑制应激颗粒形成作用机制研究构建了无血清刺激诱导PC12细胞应激颗粒形成细胞模型,对无血清诱导时间梯度刺激的PC12细胞以G3BP1和eIF3b双标观察到12h的时候生成应激颗粒的阳性细胞数最多达到55.9%,且平均每个细胞的应激颗粒数达到3.91个颗粒/细胞,确定了12h无血清刺激的PC12细胞作为应激颗粒形成的理想模型。进一步检测各组细胞miR-140表达水平,发现无血清刺激后miR-140水平持续增加,以Oh作为参照,12h时达到7.54倍,可见随着无血清的持续刺激miR-140转录活性增加,确定以12h无血清刺激PC12细胞作为本研究的细胞模型。通过删失miR-140启动子片段构建荧光素酶报告基因,确定了 miR-140启动子的核心位点位于-250bp片段内,生物信息学预测得到两个核心位点,突变核心位点序列构建荧光素酶报告基因,确定miR-140核心位点为位于-250bp内的位点1。构建位点1生物素标记的DNA探针,拉取正常组和模型组细胞核蛋白,LC-MS分析得出无血清刺激后HnrnpA1与miR-140启动子区脱结合,并经CHIP-qPCR反向验证。共转染si-HnrnpA1和-250bp片段报告基因质粒的相对荧光值高于只转染-250bp片段报告基因质粒,说明无血清刺激会导致结合于miR-140启动子核心位点上的HnrnpA1蛋白水平降低,从而证明结合在miR-140核心启动位点上的HnrnpA1可以抑制miR-140的转录激活。应用生物信息学预测得miR-140靶向HnrnpA1 3’UTR区,双荧光素酶报告基因证明miR-140可以靶向抑制HnrnpA1 转染 miR-140 mimic、inhibitor 以及 si-HnRNPA1 到 PC12 细胞,无血清刺激12h免疫荧光检测应激颗粒发现miR-140下调HnrnpA1抑制应激颗粒形成,并且通过MCAO大鼠模型侧脑室注射miR-140模拟物抑制物验证miR-140可以检测到miR-140抑制模型大鼠脑组织中应激颗粒形成加深脑缺血面积。本部分工作通过12h无血清刺激PC12细胞作为研究应激颗粒的细胞模型,体内外验证了 HnrnpA1影响miR-140启动子活性,miR-140靶向抑制HnrnpA1,并对应激颗粒的形成起到抑制作用。2.TET1介导miR-140启动子去甲基化促进miR-140-HnrnpA1轴形成机制研究基因的转录激活跟其启动子的去甲基化水平密切相关,甲基化的5位胞嘧啶5mC可以转录。TET酶通过将5mC加氧去甲基化为5hmC进而脱去甲基,使原本封闭的启动子活化。这些都提示我们,HnrnpA1很可能是通过结合在miR-140核心位点上面甲基化的位点区从而阻止TET酶与甲基化的胞嘧啶接触。无血清刺激12h时TET1表达水平显著上升,甲基化水平降低,细胞处于高去甲基化状态;沉默TET1后,细胞整体去甲基化水平降低。进一步对miR-140核心位点处的去甲基化水平研究,结果表明无血清刺激12h后miR-140核心启动位点处的去甲基化水平明显升高;对过表达HnrnpA1的PC12细胞无血清刺激诱导12h结果发现其去甲基化水平并未升高,这验证了 HnrnpA1通过结合在miR-140核心位点处甲基化的位点处,阻止了 TET1介导的去甲基化。本章我们从无血清诱导后miR-140为何会过度表达切入,探索了 TET1影响miR-140的转录调控机制。3.左旋樟脑靶向TET1抑制miR-140-HnrnpA1轴促应激颗粒形成机制研究基于TET1对miR-140的表观调控,我们通过Biacore技术在我们确定了与TET1高亲和力的是左旋樟脑,为我们干预miR-140-HnrnpA1轴从而促进应激颗粒形成提供了靶点。首先,本实验结果表明左旋樟脑可以降低模型大鼠脑组织缺血面积,抗脑损伤。其次,左旋樟脑是否是靶向结合了 TET1抑制其去甲基化作用,从而降低了 miR-140启动活性中断miR-140-HnrnpA1轴。各组大鼠脑组织冰冻切片后免疫荧光检测TET1,5mC及5hmC水平,研究发现左旋樟脑可以降低TET1蛋白水平,同时提高5mC降低5hmC的水平,即左旋樟脑靶向TET1抑制其去甲基化作用。各组大鼠脑组织提取DNA后检测miR-140启动子甲基化,发现造模后给予左旋樟脑干预的大鼠脑组织的miR-140核心启动位点区域的去甲基化水平明显降低,说明左旋樟脑是可以靶向TET1后降低miR-140核心启动子的去甲基化,同时HnrnpA1在给予左旋樟脑的模型大鼠脑组织中的水平相对于没有用左旋樟脑干预的大鼠来说显著升高。对各组大鼠的脑组织冰冻切片行免疫荧光染色,以核的荧光值作为参照,分析应激颗粒标志物G3BP1的相对荧光值,结果发现,左旋樟脑可以进一步升高缺血脑组织的应激颗粒生长,从而发挥急性应激状态下的保护作用,有利于降低脑组织的缺血面积,起到脑保护作用。