论文部分内容阅读
20世纪80年代以来，结核病(tuberculosis，TB)的疫情有重新上升的趋势，一个主要因素是结核分枝杆菌耐药性问题。随着联合药物治疗的使用，使高耐药及多耐药菌株不断出现和传播，对化疗效果及结核病的流行产生了极大影响，增加了死亡率。据世界卫生组织估计，目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，其中约有5000万人感染耐药结核分枝杆菌。不合理用药引起的结核分枝杆菌内一些酶的基因突变或缺失是产生致结核分枝杆菌耐药性的主要原因。耐药结核分枝杆菌，特别是多重耐药结核分枝杆菌的增加，严重影响了结核病的化疗效果，给结核病控制带来了极大的困难。传统的药敏试验是建立在生物生长代谢过程中的表型上，这种方法所需时间长，通常为1～2个月，不能满足现代短程化疗的需求。因此，结核分枝杆菌耐药性的快速准确检测，为尽快制定最佳治疗方案提供依据，将有效地降低耐药菌株在人群中的扩散。 近年来，由于分子生物学技术的发展，一线抗结核药物的耐药分子机制逐步被阐明，也相应地建立了一些用基因技术对结核分枝杆菌耐药性进行检测的方法，为快速检测结核分枝杆菌的耐药基因开辟了一条新的途径。目前较为成熟的基因诊断方法有DNA直接测第四军医大学硕士学位论文序法归ireet Sequencing，Ds)、杂交法、多聚酶链反应一单链构象多态性分析(polymerase Chain Reaetion一Single一strand Conformationpolymo甲hism，pCR一ssCp)法等。而PeR一sseP又以其操作简便，费用较低和快速敏感等优点，更适合在临床推广使用。 多耐药性结核病(Multiple一Drug Resistanee几berulbosis，MDR一TB)是指对2种或2种以上抗结核药物耐药的结核分枝杆菌引起的结核病，它是人类消灭结核病的一大障碍。利福平(rifampin，RFp)、链霉素(strepto娜cin，sM)和异烟脐(isoniazid，INH)是主要的抗痔一线药物，其耐药性的出现对感染患者的治疗带来很大困难。建立一种敏感、特异并且能同时检测多个药物耐药性的方法，成为临床迫切需要解决的问题，也是目前国内外研究的热点。目前虽有PCR-SSCP检测耐药基因的报道，但均为单一基因的检测，从而使目前标准的化疗方案治疗失败。为此，本研究的主要目的为:建立一种同时检测孙P、SM和E，H主要耐药基因rpoB、rpsL、katG基因突变的方法，为临床早期治疗提供快速而准确可靠的方法及依据。 首先建立检测3个耐药基因的multi一PCR方法。已经证实，RFP耐药性的产生主要是由于编码RNA聚合酶的p亚单位的编码基因印oB发生突变，大约90%一95%的突变主要发生在rp0B基因中央的81饰区域内(507一533位27个氨基酸密码子)。编码结核分枝杆菌核糖体16srRNA的rrs基因与512蛋白质的印sL基因发生突变导致耐链霉素。印sL基因突变是耐sM的主要分子机制，rpsL基因突变占SM耐药株的60%一70%，其突变多见于43，88位点。刀呵H耐药主要与过氧化氢酶一过氧化物酶的编码基因katG有关，还与即hC启动子、ixlllA基因的突变有关。K叔G基因突变占D妊J耐药株的50%一70%，主要发生在315、304位点。基于此，本实验在设计PCR特异性引物时涵盖了这3个基因突变的高发区域。rpoB基因特异性引物根据Genebank:L27989序列设计:P15’一CCC AGGACGTGG第四军医大学硕士学位论文AGG CGA TCAC一3’;P25’一TGC CGC ACC AAI，CGC TGC TC一3’，扩增片段365bp。;印sL基因特异性引物根据Genebank:L08011序列设计:P，5’一CCG CGT GII’A CAC CAC CAC TC一3’;P25’一CTAo认Goe oee AAo eGA一3’，扩增片段Zolbp。kato基因特异性弓}物根据Genebank:X68081序列设计:P15’一CGG CGATGAGCGTTA CAG一3’;P:5’一CGT CCT TGG CGG TGT ATTG一3’，扩增片段458bP。 实验中对multi一PcR反应体系中退火温度、M犷+浓度、模板DNA用量、多重引物用量、循环次数多面进行优化，选择最佳反应条件，成功建立了multi一PCR扩增方法。对H37Rv标准株和临床分离株分别采用常规PCR和multi一PCR同时进行扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100%。 按绝对浓度间接法进行药敏试验。78株临床分离株中，敏感株22株，耐药株56株，耐多药株51株。其中，耐利福平46株，高耐药株33株，低耐药株13株;耐链霉素43株，高耐药株34株，低耐药株9株;耐异烟腆45株，高耐药株35株，低耐药株10株。 用单基因PCR一SSCP法分别扩增结核分枝杆菌H37Rv和78株临床分离株的rp0B、印sL、katG基因，并将扩增产物进行sscP电泳分析。共检出48株突变株，其中耐药株中检出47株(83.9%)，敏感株中检出1株(4 .5%)。印OB基因突变发生率为87%(40/46)，另检出1株敏感株突变;rpsL基因突变发生率为74.4%(犯/43);katG基因突变发生率为“.7%(30/45)。 将56株耐药临床株和1株PCR一SSCP法检出突变的敏感株的扩增产物切下进行胶回收，然后进行测序分析。共检出50株突变株，其中1株即为ssCP法检出突变的敏感株。检出rpoB基因突变发生率89.1%(4一/46);印sL基因突变发生率74.4%(犯/43);katG基因突变发生率68.9%(31/45)。