研究背景、目的及意义糖尿病慢性溃疡是糖尿病最严重的并发症之一。糖尿病慢性溃疡治疗困难,一直是临床工作的一大挑战,易并发感染,感染严重的会导致截肢甚至死亡。糖尿病溃疡普遍存在着上皮化缓慢、血管神经受损等问题。因此,研究糖尿病皮肤慢性溃疡难愈的机制,发现促进愈合的关键因素,寻求经济有效的治疗手段非常必要。课题组前期研究发现,自发性糖尿病小鼠和野生型正常小鼠皮肤组织结构有较大差异,自发性糖尿病小鼠皮肤中交感神经特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达显著高于正常小鼠,在创面形成后正常小鼠酪氨酸羟化酶的表达迅速增高而后回落至正常水平,而糖尿病小鼠愈合过程中酪氨酸羟化酶升高延迟。酪氨酸羟化酶蛋白水平表达增高时,儿茶酚胺类物质增加,糖尿病小鼠炎症期时间延长,从而导致创面愈合整个过程的减慢。有研究表明,创伤和应激导致血液及组织中儿茶酚胺升高,而高水平的儿茶酚胺抑制创面的愈合。普萘洛尔作为一种非选择性的β受体阻滞剂,它最早用于心血管疾病治疗,具有拮抗交感神经兴奋和儿茶酚胺的作用。对小儿烧伤患者住院期间予以普萘洛尔治疗能减轻代谢亢进并逆转肌肉蛋白质的分解代谢,促进烧伤创面愈合。本研究在前期工作基础上,使用非选择性β受体阻滞剂普萘洛尔对正常小鼠及自发性糖尿病小鼠进行处理,抑制交感神经活动,制作创面模型,观察小鼠创面愈合情况,重点检测自发性糖尿病小鼠β受体阻滞剂普萘洛尔处理后创面愈合情况,探讨β肾上腺素受体阻滞剂对糖尿病小鼠皮肤创面愈合的作用。研究方法1.普萘洛尔对正常小鼠创面愈合的影响:雌性C57BL/6J小鼠20只,分为两组,每组10只。普萘洛尔组予50mg普萘洛尔溶于100ml饮水中,对照组正常饮水,持续给药1周后在小鼠背部制作全层皮肤缺损创面。创面制作后普萘洛尔组继续给药直至安乐死。创面形成后1d、3d、5d、7d、10d数码相机拍照,观察创面愈合情况,测量创面的面积并计算创面愈合率;HE染色观察创面组织再上皮化、炎症反应、肉芽生长及新生血管等情况,组织学评分进行比较。2.普萘洛尔对糖尿病小鼠创面愈合的影响:雌性糖尿病小鼠18只,分为两组,每组9只。在糖尿病小鼠背部制作全层皮肤缺损创面。普萘洛尔组及对照组创面分别外用涂抹普萘洛尔乳膏及乳膏基质(除了不含普萘洛尔,乳膏基质成分与普萘洛尔组乳膏成分完全一致)。创面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d换药,换药时普萘洛尔组及对照组创面再次分别涂抹普萘洛尔乳膏及乳膏基质,数码相机拍照,并随机抽取一只小鼠取材。测量创面的面积并计算创面愈合率,21d剩余3只糖尿病小鼠全部处死取材。HE染色、Masson染色、甲苯胺蓝染色分别观察创面的再上皮化、胶原纤维及肥大细胞情况;PCNA、CD68免疫组化查看细胞增殖及巨噬细胞浸润情况。Western blot检测创面组织中PCNA、白细胞介素-1β(IL-1β)、血管生成素2(Ang2)、MMP-9的表达。研究结果1.正常小鼠创面形成后1d、3d、5d、7d创面愈合率比较,普萘洛尔组均高于对照组,在3d、5d比较,p<0.05有明显差异,而1d、7d比较,p>0.05;10d两组创面均完全愈合。创面HE染色可见,组织学评分发现普萘洛尔组早期创面再上皮化及肉芽组织生长均高于对照组,而新生血管无明显差异。2.糖尿病小鼠创面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d创面愈合率比较,普萘洛尔组均高于对照组,且p<0.05;创面形成后第21d,普萘洛尔组已经愈合,对照组未完全愈合,p>0.05。HE染色,普萘洛尔组的再上皮化速度明显快于对照组,早期阶段炎症浸润较明显,后期较弱。Masson染色提示普萘洛尔组与对照组胶原表达量及胶原排列情况差异不明显。甲苯胺蓝染色,两组创面组织内肥大细胞均分布较少。PCNA免疫组化结果显示普萘洛尔组早期角质形成细胞增殖明显增加。CD68结果显示,普萘洛尔组创面组织早期有巨噬细胞浸润表达而后期表达不明显;对照组创面组织早期巨噬细胞表达不明显而后期明显表达。Western blot结果显示普萘洛尔组IL-1β、Ang2表达均低于对照组,P<0.05;2d普萘洛尔组PCNA表达高于对照组;普萘洛尔组MMP-9表达在2d、5d、7d、10d均较对照组高。研究结论1.普萘洛尔加速创面的再上皮化促进了正常小鼠的创面愈合;2.普萘洛尔明显促进自发性糖尿病小鼠的创面愈合,机制是其能明显促进再上皮化,减轻炎症反应,及新生血管的稳定;3.外用普萘洛尔可能成为治疗糖尿病溃疡的一种新的手段,值得深入研究。