树突状细胞(dendritic cell，DC)是一种专职抗原递呈细胞，能启动初始T细胞发生免疫应答，在免疫系统中居于独特的地位。DC是异质性细胞群体，具有不同亚群及不同功能状态。成熟DC有很强的免疫激活作用，可启动初始免疫应答；非成熟DC则显示出较强的致耐受活性，但这种致耐受活性通常随DC成熟而转变成免疫原性。目前研究表明，促进DC的成熟与功能，在抗肿瘤及抗感染治疗方面意义重大；而抑制DC的成熟，对于在移植排斥反应和自身免疫病中诱导抗原特异性T细胞耐受具有重要意义。所以，有关DC发育成熟的调控因素与机制研究，已成为当今免疫学研究的热点。 α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)是一种具有抗炎和免疫调节功能的神经肽，通过MC1R～MC5R五型受体介导其生物活性。近期研究发现，在人外周血单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived dendritic cell，MoDC)上表达有α-MSH受体MC1R。α-MSH能下调MoDC的CD86、CD40表达，提示α-MSH可能对DC的成熟和功能具有重要的调节作用。而已知肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及新近发现的表达于髓系细胞的激发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)都可促进DC前体发育成熟。 基于上述研究，本课题进一步研究了α-MSH对TNF-α或激活TREM-1诱导的MoDC成熟是否有调节作用，以及相关的机制如何。 第一部分 α-黑素细胞刺激素对人单核细胞来源的树突状细胞成熟的调节作用 取健康献血者的白细胞，用本室已建立的方法从中分离得到单核细胞，联第二军医大学硕士学位论文合使用GM一CSF及IL4诱导单核细胞分化为MoDC。将培养的MODC分为不同处理组:仅使用GM一CSF及IL4诱导分化的MoDC;加用TNF一。或激动性TREM一1抗体刺激的MoDC(TNF一Q处理的MoDC或TREM一1抗体处理的MoDC);加入a一MSH作用于MoDC(a一MSH处理的MoDC);在每次加TNF一a或TREM一1抗体Zh前，加入(:一MSH作用于MoDC(a一MSH+TNF一a处理的MoDC或a一MSH+TREM一1抗体处理的MoDC)。收获培养第8天的各组MoDC进行下述实验:(1)观察细胞形态差异;(2) FACS检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力;(3)混合淋巴细胞培养检测MoDC刺激同种异体T细胞增殖的能力;(4)检测MoDC的抗原递呈能力;(5) ELISA检测MoDC产生IL12的水平。 结果表明:TNF一a处理的MODC具有成熟DC的特征，与其相比，a一MSH+TNF一Q处理的MoDC树突不够明显，呈单核细胞状;表面分子CD86、MHCH、CDla及CD83降低;摄取抗原的能力较强;刺激同种异基因淋巴细胞增殖的能力较弱;向同基因T细胞提呈抗原并刺激其增殖的能力也较弱;分泌正12降低。说明Q一MSH可抑制TN下一a诱导的MODC成熟。 TREM一1激动性抗体处理的MODC具有成熟DC的特征，与其相比，a一MSH+TREM一1抗体处理的MoDC树突不够明显，表面分子CD86、MHC 11、CDla及CD83表达下降，提示TREM一1介导的MoDC成熟可被。一MSH抑制。用FACS检测了MoDC表达TREM一1的情况，发现培养3天与7天的MoDC表达TREM一1均较低;将培养7天的DC用廿S刺激24h后，TREM一1表达明显升高。将培养7天的Q一MSH处理的MoDC用LPS刺激24h后，TREM一1表达与仅用廿S刺激相比，上调幅度减小。表明。一MSH可抑制廿S刺激DC引起的TREM一1上调。第二部分。一黑素细胞刺激素调节人单核细胞来源的树突状细胞成熟的机制初探为了探讨Q一MSH抑制TNF一a诱导MODC成熟的机制，本部分实验中，首第二军医大学硕士学位论文先取TNF一Q处理的MODC与。一MSH+TNF一Q处理的MODC进行全蛋白双向电泳图谱分析，发现两者间产生差异的蛋白质斑点37个。然后对Q一MSH+TNF一a处理的MoDC表达明显上调的3个蛋白质斑点进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术分析鉴定，得到肤质量指纹图谱。通过数据库检索分析，确定这3个蛋白质分别为膜联蛋白I(Annexinl)、维甲酸受体相关的孤儿受体一a(retinoid acid reeeptor一relatedo甲han reeeptor一alpha)、胃癌多药抗性蛋白突变体(gastrie caneer multi一drug resistanee protein variant)。进一步用Western一Blot方法检测了Annexinl的表达水平，证实了Annexin工在Q一MSH+TNF一Q处理的MODC中表达升高。提示a一MSH抑制TNF一Q诱导MoDC成熟与膜联蛋白I、维甲酸受体相关的孤儿受体、胃癌多药抗性蛋白突变体表达上调有关。 已知NF一KB转录因子在DC的成熟过程中起到重要作用，。一MSH可抑制不同炎性因子对某些细胞NF一KB的激活。为了探讨Q一MSH抑制TNF一a诱导的MoDC成熟，是否也涉及对NF一KB激活的抑制，故进行了EMSA检测，结果表明:与TNF，a处理的MoDC相比，Q一MSH+TNF一a处理的MODC核蛋白抽提物中NF一KB与DNA结合下降，说明Q一MSH可抑制MODC中NF一KB与DNA的结合。 本实验研究发现Q一MSH对TNF一Q或TREM一1激动性抗体诱导的MoDC成熟具有抑制作用，其机制与细胞内的膜联蛋白I、维甲酸受体相关的孤儿受体、胃癌多药抗性蛋白突变体表达上调以及NF一KB与DNA结合降低有关。本研究为阐明DC成熟的调控机制，以及进一步研究以DC为靶标的措施用于防治?