研究背景恶性胸腔积液是恶性肿瘤病人特别是肺癌患者常见的并发症,多属于恶性肿瘤进展或复发的结果,常提示预后不良,其常见原因以肺癌（约占35%）多见,且多为肺腺癌。针对恶性胸腔积液进行治疗可减轻或消除症状,提高或改善生存质量。常规治疗采用全身化疗加胸腔穿刺抽取积液后局部注射化疗药物的方法,但疗效往往不佳。化疗药物在灭杀肿瘤细胞的同时,对正常细胞也不加选择的造成了严重损伤,甚至危害病人的生命,并且化疗药物的反复使用可以造成肿瘤细胞的耐药,是影响肿瘤化疗效果的重要因素,其中多药耐药又是化疗失败的主要原因之一。因此研究选择性好、副作用小的新治疗方法成为研究的热点。超声治疗是近年来继肿瘤热疗、冷冻、微波等物理疗法后,开发应用的肿瘤治疗新技术。用高强度聚焦超声（High Intensity Focused Ultrasound,HIFU）治疗实体肿瘤的研究已大量报道,但当肿瘤细胞位于胸腔、腹腔积液中或弥漫浸润时,聚焦超声难以灭杀这些细胞。本课题组在前期研究中采用非聚焦超声（None-Focused Ultrasound,NFU）灭杀悬液中的GLC-82肺腺癌细胞,取得了一定效果。由于超声波在组织传播的过程中,其能量随传播距离的增加而呈指数级衰减,因而导致NFU治疗时靶区能量减低、疗效下降。烟酰胺（Nicotinamide,NA）是烟酸的酰胺衍生物,辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成成分,在生物氧化中起递氢作用,促进生物氧化和组织的新陈代谢,其安全范围较广,只有大剂量使用才会引起维生素过多症,近年来作为放射增敏剂的研究颇受关注。能否应用NA来增强NFU对肺腺癌细胞的灭杀作用呢?这种增敏作用对肺腺癌细胞的灭杀机制如何?对不同肺腺癌细胞的灭杀作用是否一致?在灭杀肺腺癌细胞的同时是否也会灭杀正常细胞?与常用化疗药物相比其灭杀效果如何?基于对以上问题的回答我们设计了本课题。目的及意义探讨NA增敏NFU对肺腺癌细胞灭杀作用的普遍性及其灭杀机制,明确NA增敏NFU对肺腺癌细胞的灭杀作用是否具有特异性,比较NA增敏NFU对肺腺癌细胞的灭杀作用与常用的4种化疗药物对肺腺癌细胞灭杀作用的强弱,为NA增敏NFU对肺腺癌性恶性胸水的临床治疗研究提供实验基础。方法一、烟酰胺增敏非聚焦超声灭杀悬液中A549肺腺癌细胞的作用1.实验材料及分组实验采用A549肺腺癌细胞,将其分为空白对照组、单纯NA作用组、单纯NFU作用组、NA增敏NFU作用组。2.测定细胞的增殖抑制率和增敏比确定实验剂量通过四氮甲唑蓝（MTT）比色法观察浓度分别为0、1、2、3、4、5mg/ml的NA与依次给予0、20、30、40、50、60、70W/cm²×5s辐照剂量的NFU辐照后,细胞增殖抑制率的变化,通过SPSS13.0软件按Probit法求出半数抑制浓度(IC₅₀值)和增敏比（SER）。3.实验方法观察NA增敏NFU处理后4组A549细胞的形态变化;台盼蓝拒染法测NA增敏NFU处理后细胞的即刻及24h存活率;MTT法检测24h细胞的增殖率;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率变化;克隆形成实验检测细胞集落形成能力。二、烟酰胺增敏非聚焦超声对悬液中A549肺腺癌细胞的灭杀机制1.实验材料及分组实验采用A549肺腺癌细胞,将其分为空白对照组、单纯NA作用组、单纯NFU作用组、NA增敏NFU作用组。2.实验方法通过核仁组成区染色观察NA增敏NFU处理后4组A549细胞核仁组成区嗜银蛋白（AgNOR）颗粒数;利用MTT法绘制不同组别细胞生长曲线,反映NA增敏NFU处理后4组A549细胞的增殖能力变化;利用Hoechst33342荧光染色、AO/EB荧光双染及透射电镜观察A549细胞凋亡变化,利用琼脂糖凝胶电泳观察A549细胞凋亡DNA Ladder的产生;观察细胞培养液颜色变化并计数4组A549细胞不同处理前后细胞数量的变化;免疫细胞化学方法检测4组A549细胞中p53、Bcl-2、Ki-67蛋白表达水平的变化,通过BCA法和蛋白质凝胶电泳法检测4组A549细胞培养液中及细胞内蛋白量的变化。三、烟酰胺增敏非聚焦超声对不同肺腺癌细胞及永生化支气管上皮细胞灭杀作用的比较1.细胞株采用人肺腺癌细胞株A549细胞、GLC-82细胞、对顺铂（CDDP）耐药的GLC-82/CDDP细胞、鼠Lewis肺腺癌细胞株LLC细胞及人永生化支气管上皮细胞系HBE细胞。2.实验分组实验分为空白对照组、单纯NA作用组、单纯NFU作用组、NA增敏NFU作用组。3.实验方法采用药物大剂量冲击法及间歇作用法,诱导对CDDP耐药的GLC-82/CDDP细胞,通过MTT法检测不同浓度的CDDP对GLC-82细胞和GLC-82/CDDP细胞的增殖抑制率,计算出IC₅₀值和耐药指数（Resistance Index,RI）;通过台盼蓝拒染法检测不同处理后上述5株细胞的即刻及24h存活率,MTT法检测细胞的24h增殖率,流式细胞仪检测24h凋亡率,比较不同处理后5株细胞存活率、增殖率、凋亡率的变化。四、烟酰胺增敏非聚焦超声法与常用四种化疗药物灭杀肺腺癌细胞的效果比较1.细胞株采用人肺腺癌细胞株A549细胞、GLC-82细胞、GLC-82/CDDP细胞及人永生化支气管上皮细胞系HBE细胞。2.药物及浓度顺铂（CDDP）:体外实验浓度（相当于血浆药物浓度）为13.6μg/ml;紫杉醇注射液（PTX）:体外实验浓度（相当于血浆药物浓度）为119μg/ml;注射用盐酸吉西他滨（GEM）:体外实验浓度（相当于血浆药物浓度）为850μg/ml;盐酸博莱霉素（BLM）:体外实验浓度（相当于血浆药物浓度）为3μg/ml。3.实验分组实验分为NA-NFU辐照10s组、NA-NFU辐照5s组、CDDP作用组、PTX作用组、GEM作用组、BLM作用组。4.实验方法通过MTT法检测上述6组不同处理后的细胞增殖抑制率,比较6组不同处理对上述4株细胞的灭杀效果。结果一、烟酰胺增敏非聚焦超声对悬液中A549肺腺癌细胞的灭杀效果1.NA-NFU作用后,倒置显微镜下见A549细胞形态变圆,细胞皱缩,折光性差,出现较多漂浮的死细胞,细胞间可见细胞碎片和类焦化物质;HE染色后可见A549细胞形态改变明显,细胞细长,胞浆稀少,细胞核固缩、核碎裂数量明显增多,核分裂数明显减少;2.当NA浓度≥3mg/ml时可以显著提高NFU对A549细胞的灭杀作用;NA在2-5mg/ml范围内,其增敏作用随剂量的增加而增大;当使用3mg/ml的NA增敏30W/cm²×5s的NFU时对A549细胞的抑制率为51.48%,其IC₅₀已达到50%;3.3mg/ml的NA单独作用后A549细胞的24h增殖率、克隆形成能力、凋亡率及细胞周期的变化与空白对照组之间差异均无统计学意义（P＞0.05）;4.NA-NFU、NFU、NA、Control 4组处理后A549细胞的存活率、24h增殖率、24h凋亡率、克隆形成能力差异均有统计学意义（P＜0.05）;NA-NFU组细胞与Control、NA、NFU 3组比较其即刻及24h存活率、24h增殖率、克隆形成能力均明显下降,24h凋亡率明显上升,差异均有统计学意义（P＜0.05）;二、烟酰胺增敏非聚焦超声对溶液中A549肺腺癌细胞的灭杀机制1.NA-NFU处理后A549细胞核内AgNOR颗粒数量和分布上均出现了明显变化:细胞核内AgNOR颗粒数量减少甚至缺失,与Control、NA与NFU组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）;NA-NFU处理后A549细胞体外增殖能力低于Control、NA及NFU组,差异有统计学意义（P＜0.05）,6d内生长曲线持续平坦,未见明显上扬;NA的存在与NFU具有交互效应,即NA能够增强NFU对A549细胞的体外增殖能力的抑制;2.NA-NFU处理后24h通过Hoechst33342荧光染色、AO/EB荧光双染及透射电镜观察均能见到典型的凋亡变化;琼脂糖凝胶电泳图中可见典型的DNA-Ladder条带;3.NA-NFU组和NFU组处理后A549细胞数量明显少于处理前（P＜0.05）,而Control组和NA组处理前后差异无统计学意义（P＞0.05）;4.细胞免疫组化检测显示:p53在NA-NFU组和NFU组中有少量细胞表达,在Control组与NA组表达均呈阴性;Bcl-2在4组中表达均呈阴性;Ki-67在4组中呈阳性表达,其PI依次为NA-NFU组（98.6%）＞NFU组（89.4%）＞Control组（17.2%）和NA组（15%）;5.NFU处理后A549细胞培养液中蛋白浓度增加,而细胞内蛋白浓度下降,NA-NFU组更明显;这一作用可能与NFU作用细胞后可以破坏细胞膜或增加膜的通透性有关。三、烟酰胺增敏非聚焦超声对不同肺腺癌细胞及永生化支气管上皮细胞灭杀作用的比较1.不同浓度的CDDP作用于GLC-82细胞和GLC-82/CDDP细胞后,两株细胞的增殖抑制率差异有统计学意义（P＜0.001）;对于GLC-82细胞,CDDP的IC₅₀为0.190μg/ml,而GLC-82/CDDP细胞,CDDP的IC₅₀为1.444μg/ml,GLC-82/CDDP细胞的耐药指数（RI）为7.6;2.单独NFU辐照处理后,A549、GLC-82、GLC-82/CDDP、LLC及HBE 5株细胞存活率、增殖率、凋亡率之间差异均无统计学意义（P＞0.05）;而在NA-NFU处理后,5株细胞间凋亡率虽差异无统计学意义,但存活率、增殖率间差异却有统计学意义（P＜0.05）,人支气管上皮细胞HBE的存活率及增殖率高于3株人肺腺癌细胞（A549、GLC-82及GLC-82/CDDP）,P值均小于0.05;鼠肺腺癌LLC细胞存活率及增殖率均低于上述4株细胞（P＜0.05）。四、烟酰胺增敏非聚焦超声法与常用的四种化疗药物灭杀不同人肺腺癌细胞及永生化支气管上皮细胞的效果比较1.NA-NFU辐照处理10s对A549、GLC-82、GLC-82/CDDP及HBE细胞的增殖抑制率大于辐照时间为5s（P＜0.05）;4种化疗药物中CDDP、PTX处理后上述4株细胞的增殖抑制率大于NA-NFU辐照处理（P＜0.05）,而GEM、BLM处理后4株细胞的增殖抑制率小于用NA-NFU辐照处理（P＜0.05）;2.在NA-NFU辐照的A549、GLC-82、GLC-82/CDDP及HBE细胞中,作为正常对照的HBE细胞的增殖抑制率低于A549、GLC-82及GLC-82/CDDP细胞（P＜0.05）;常用的4种化疗药物对GLC-82/CDDP细胞的增殖抑制率则明显低于A549、GLC-82及HBE细胞（P＜0.05）,HBE细胞在PTX作用后增殖抑制率低于A549及GLC-82细胞（P＜0.05）,在CDDP、GEM及BLM 3种化疗药物处理后的HBE细胞的增殖抑制率与A549及GLC-82细胞差异无统计学意义（P＞0.05）;3.NA-NFU辐照后第1d对A549、GLC-82、GLC-82/CDDP及HBE细胞的增殖抑制能力最强,而在第2d、第3d则略有下降;化疗药物对上述4株细胞的增殖抑制率正好相反,作用后第1d对4株细胞的抑制能力最弱,而在第2d、第3d则逐渐增强。结论1.NA-NFU辐照对悬液中多种肺腺癌细胞具有灭杀作用,其灭杀效果与肺癌常用的化疗药物CDDP、PTX、GEM及BLM相近,但对耐药的肺腺癌细胞的灭杀效果却明显优于化疗药物;NA-NFU辐照在对肺腺癌细胞灭杀的同时对正常细胞（人支气管上皮永生化细胞）有轻微损伤作用,但这种损伤作用明显小于化疗药物的损伤作用。2.3mg/ml的NA对A549肺腺癌细胞无明显毒性作用;NFU作用于A549细胞后可降低其存活率,持续抑制其增殖,诱导其凋亡,并致部分细胞直接碎裂;NA可以增强NFU对A549细胞的灭杀作用。3.NA浓度≥3mg/ml时,对NFU灭杀肺腺癌细胞具有明显的增敏作用;NA在2-5mg/ml范围内,其增敏作用随剂量的增加而增大。