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背景:研究发现NOX4和Rho A都在纤维化中起重要作用且两者相互调节:在肺纤维化中,NOX4/ROS为Rho A/ROCK1信号通路的上游分子;在肾纤维化中,两者恰好相反。目前未见两者在肝纤维化中是否存在上述类似或其他调节机制的报道。我们前期研究发现熊果酸(UA)能通过下调肝星状细胞(HSC)中NOX4/ROS的表达,抑制Rho GTP酶家族成员中Rac1的表达,逆转肝纤维化。但UA对Rho GTP酶家族另一重要成员Rho A的作用未见报道。据此我们设想,Rho A/ROCK1有可能是除NOX4/ROS之外另一条在肝纤维化发生发展过程中起重要作用的信号通路,并且它们两条信号通路之间可能存在相互调节作用;UA可能通过抑制HSC中Rho A/ROCK1信号通路的激活,进而抑制NOX4/ROS与Rho A/ROCK1的相互作用而影响HSC的生物学行为,从而达到逆转肝纤维化的目的。目的:探究NOX4/ROS和Rho A/ROCK1信号通路对HSC-T6细胞行为学的影响及它们之间的相互作用机制;观察UA对两条信号通路的影响,以阐明UA减轻肝纤维化过程中对HSC-T6细胞增殖、迁移、活化的可能机制。方法:利用慢病毒转染技术将相关慢病毒颗粒转入HSC-T6细胞,构建NOX4-sh RNA(NOX4i)、NOX4-OE及Rho A-sh RNA(Rho Ai)稳定细胞株,将细胞分为CON组(空白病毒对照组)、CON+UA(50μmol/L)组、NOX4i组、Rho Ai组、NOX4OE组及NOX4OE+UA(50μmol/L)组。在用TGF-β1(10ng/m L)刺激48小时之后,利用MTS法测定各组细胞增殖水平;利用TUNEL法测定各组细胞凋亡水平;利用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验检测各组细胞的迁移水平;利用DCFH-DA法测定各组细胞内ROS水平;利用RT-q PCR测定各组Nox4、Rhoa、Rock1、Alphasma、Col1a1、Mmp1与Timp1的m RNA表达水平;利用Western-blotting检测各组NOX4、Rho A、ROCK1、α-SMA、Collagen-I、MMP1、TIMP1及F-actin的蛋白表达水平;利用免疫荧光法测定各组F-actin的荧光强度;NOX4OE稳定细胞株中利用Co IP(Co-Immunoprecipitation)技术探究NOX4与Rho A的相互作用;利用Biacore技术探究体外全长蛋白NOX4与Rho A间相互作用。结果:1.NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞增殖、凋亡的影响1.1 NOX4与RhoA对TGF-β1导致的HSC-T6细胞增殖的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,CON+UA(50μmol/L)组(0.674±0.972)、NOX4i组(0.580±0.990)和Rho Ai组(0.617±0.947)相较CON组(0.872±0.135)增殖水平下降(p<0.05);NOX4OE组(1.177±0.102)相较CON组(0.872±0.135)上升(p<0.05);NOX4OE+UA(0.781±0.083)组比NOX4OE组(1.177±0.102)下降(p<0.05)。结果说明,NOX4及Rho A能促进HSC-T6细胞增殖;UA能抑制HSC-T6细胞增殖。1.2 NOX4与RhoA对TGF-β1导致的HSC-T6细胞凋亡的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,CON+UA(50μmol/L)组[(1.980±0.179)%]相较CON组[(1.044±0.131)%]凋亡细胞比例明显上升(p<0.01),但NOX4i组[(1.141±0.011)%]、Rho Ai组[(0.940±0.106)%]和NOX4OE组[(0.883±0.083)%]凋亡细胞比例相比CON组[(1.044±0.131)%]并无统计学差异(p>0.05);NOX4OE+UA组[(1.580±0.921)%]比NOX4OE组[(0.883±0.083)%]凋亡细胞比例显著上升(p<0.01)。结果说明,NOX4及Rho A对HSC-T6细胞凋亡并无影响;UA能促进HSC-T6细胞凋亡。2.NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞迁移、侵袭的影响2.1 NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞迁移的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,CON+UA(50μmol/L)组(274.046±12.036)、NOX4i组(166.873±8.624)、Rho Ai组(178.837±11.696)相较CON组(413.920±10.851)迁移指数下降(p<0.05);NOX4OE组(537.433±11.976)相较CON组(413.920±10.851)显著上升(p<0.01);NOX4OE+UA组(217.964±7.788)比NOX4OE组(537.433±11.976)下降(p<0.05)。结果说明,NOX4及Rho A能促进HSC-T6细胞迁移;UA能抑制HSC-T6细胞迁移。2.2 NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞侵袭实验的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,CON+UA(50μmol/L)组(1.609±0.092)、NOX4i组(1.577±0.137)、Rho Ai组(1.087±0.132)相较CON组(0.438±0.393)侵袭程度上升(p<0.05);Rho Ai组(1.087±0.132)相较NOX4i组(1.577±0.137)侵袭程度下降(p<0.05);NOX4OE+UA组(0.945±0.074)相较NOX4OE组(0.632±0.052)上升(p<0.05)。结果说明,NOX4能抑制HSC-T6细胞侵袭,Rho A能促进HSC-T6细胞侵袭;UA能促进HSC-T6细胞侵袭。3.NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞内ROS水平的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/mL)作用48h后,CON+UA(50μmol/L)组(23068.560±6992.552)、NOX4i组(20428.110±2040.489)相较CON组(33973.330±11415.949)细胞内ROS含量下降(p<0.01);NOX4OE组(45943.560±2210.026)相较CON组(33973.330±11415.949)显著上升(p<0.01);NOX4OE+UA组(20359.220±1527.088)比NOX4OE组(45943.560±2210.026)下降(p<0.01)。结果说明,NOX4能促进HSC-T6细胞内ROS含量,Rho A对ROS含量无影响;UA能降低HSC-T6细胞内ROS含量。4.NOX4与Rho A对TGF-β1导致的HSC-T6细胞细胞骨架F-actin的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,比较各组细胞内F-actin染色强度:CON+UA(50μmol/L)组[(2.827±0.223)×106]、NOX4i组[(1.532±0.204)×106]及Rho Ai组[(1.605±0.115)×106]相较CON组[(5.124±0.165)×106]均下降(p<0.05);NOX4OE组[(7.947±0.175)×106]相较CON组[(5.124±0.165)×106]显著上升(p<0.01);NOX4OE+UA组[(3.603±0.215)×106]比NOX4OE组[(7.947±0.175)×106]下降(p<0.05)。结果说明,NOX4及Rho A能促进HSC-T6细胞内F-actin聚合;UA能降低HSC-T6细胞内F-actin聚合。5.UA干预对TGF-β1导致的HSC-T6细胞NOX4/ROS及Rho A/ROCK1信号通路相关基因m RNA表达的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/m L)作用48h后,与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组Nox4 m RNA表达均下降(p<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组下降(p<0.05);与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组、Rho Ai组Rhoa、Rock1、Alphasma、Col1a1、Timp1 m RNA表达均下降(p<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组下降(p<0.05);与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组、Rho Ai组Mmp1m RNA表达均上升(p<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组上升(p<0.05)。结果说明,抑制Nox4 m RNA表达能抑制Rhoa m RNA表达,但抑制Rhoa m RNA并不会抑制Nox4 m RNA表达;抑制Nox4 m RNA及Rhoa m RNA能抑制Rock1、Alphasma、Col1a1及Timp1 m RNA表达但能促进Mmp1m RNA表达;UA能抑制Nox4、Rhoa、Rock1、Alphasma、Col1a1及Timp1m RNA表达,并促进Mmp1m RNA表达。6.UA干预对TGF-β1导致的HSC-T6细胞NOX4/ROS及Rho A/ROCK1信号通路相关蛋白表达的影响HSC-T6细胞经TGF-β1(10ng/mL)作用48h后,与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组NOX4蛋白表达均下降(p<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组下降(p<0.05);与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组、Rho Ai组Rho A、ROCK1、α-SMA、Collagen-I、TIMP1及F-actin蛋白表达均下降(p<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组下降(p<0.05);与CON组相比,CON+UA组、NOX4i组、Rho Ai组MMP1蛋白表达均上升(P<0.05),NOX4OE+UA组相较NOX4OE组上升(p<0.05)。结果说明,抑制NOX4蛋白表达能抑制Rho A蛋白表达,但抑制Rho A蛋白表达并不会抑制NOX4蛋白表达;抑制NOX4蛋白及Rho A蛋白表达能抑制Rho A、ROCK1、α-SMA、Collagen-I、TIMP1及F-actin蛋白表达表达但能促进MMP1蛋白表达;UA能抑制NOX4、Rho A、ROCK1、α-SMA、Collagen-I、TIMP1及F-actin蛋白表达,并促进MMP1表达。7.NOX4与Rho A蛋白间相互作用7.1 NOX4OE稳定细胞株内NOX4及Rho A免疫共沉淀(Co IP)在NOX4OE稳定细胞株中,P67phox与Rac1蛋白存在相互结合,NOX4与Rac1、P67phox与Rho A、NOX4与Rho A均不存在相互结合。7.2体外全长NOX4与Rho A纯蛋白Biacore蛋白互作分析体外全长NOX4与Rho A纯蛋白结合并不呈典型浓度依赖曲线,结果表明NOX4及Rho A蛋白不存在直接相互作用。结论:1.NOX4/ROS及RhoA/ROCK1两条信号通路能促进HSC-T6细胞的增殖、迁移、活化;UA可能是通过抑制两条信号通路激活进而抑制细胞增殖、迁移、活化,但其诱导HSC-T6细胞凋亡的机制与此两条通路无关;2.HSC-T6细胞内NOX4/ROS通路是Rho A/ROCK1通路的上游信号通路,并对Rho A/ROCK1通路起正向调控作用;NOX4与Rho A蛋白间可能不存在直接的相互结合作用。