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新近的WHI临床资料分析指出：在接近绝经或绝经早期开始给予雌激素替代治疗,可减少女性冠心病的发病率,但对于绝经晚期或年龄>60岁的妇女,补充雌激素的这种心血管保护效应丧失。WHI的这一结论提出了一个极具挑战性的理论问题：如果雌激素替代治疗对心血管系统具有保护作用,为什么用于绝经早期和晚期妇女时会出现不同的效应?血管平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)向内皮下层的迁移和增殖及其所导致的新内膜形成(或内膜增厚)是动脉粥样硬化发展早期的重要病理特征之一。众多研究证实,雌激素可显著减轻各种损伤或致动脉粥样硬化因素所引起的动脉内膜增厚。因此,大多数学者认为,雌激素的抗动脉粥样硬化效应机制之一是抑制血管SMC增殖。然而,不少研究显示,雌激素对SMC的直接作用不是抑制,而是促进其增殖。近年的研究证实,在血管壁内(特别是外膜)驻存着干细胞/前体细胞(vascular wall-resident stem/progenitor cells; VRS/Pcs)。这些细胞在正常条件下处于相对静止状态,当到受损伤刺激时,很可能是这些VRS/Pcs被迅速激活,向内皮下层迁移、增殖、并合成大量细胞外基质,导致内膜增厚。在对上述研究进展进行深入分析的基础上,我们推测：雌激素在体内对血管SMC的作用很可能并不是简单地抑制其增殖,而很可能是通过影响VRS/Pcs的增殖和分化,维持中膜细胞的稳态和血管壁的正常修复能力。为检验这一假设,本研究观察了雌性青年和老年大鼠动脉壁内CD34+ VRS/Pcs的分布,分析了雌激素对大鼠CD34+ VRS/Pcs增殖及分化的影响,并通过阻断实验探讨了其作用的机制。第一部分：CD34+ VRS/Pcs在青年及老年雌性大鼠动脉壁内的分布及分离、纯化和分化潜能的研究目的：观察CD34+ VRS/Pcs在青年及老年雌性大鼠不同动脉壁内的分布,摸索及建立分离、纯化及培养血管壁内CD34+ VRS/Pcs的方法,并检测这些CD34+VRS/Pcs向血管SMC及内皮细胞的分化潜能。方法：采用免疫组织荧光染色方法检测青、老年雌性SD大鼠胸主动脉、主动脉弓及头臂干壁内表达干细胞表面标志CD34、成熟SMC细胞标志SM MHC或SM22以及内皮细胞表面标志CD31的细胞的分布,比较青年及老年大鼠胸主动脉壁中CD34+ VRS/Pcs阳性细胞率。采用组织贴块法从青年大鼠主动脉外膜组织分离CD34+细胞、磁珠分选后,流式细胞术对细胞进行纯度鉴定,并采用PDGF-BB或VEGF诱导实验检测其向SMC、内皮细胞分化的潜能。结果：1、在所检测的动脉中,CD34+细胞分布于外膜和内皮层,其中内皮层CD34+细胞同时表达成熟内皮细胞标志CD31,外膜CD34+细胞不表达CD31及成熟SMC标志SM MHC;中膜全层除SM MH C+成熟SMC外,未见CD34+或共表达CD34和SM MHC的细胞。老年大鼠外膜中CD34+ VRS/Pc平均百分率(12.66±4.09%；N=6)显著低于青年大鼠(32.09士7.69%)。2、从外膜组织分离的细胞在磁珠筛选前,CD34+细胞的纯度为19.9士2.48%；筛选后的纯度显著升高,达85.07士4.16%；筛选后的细胞不表达成熟内皮细胞(CD31)和SMC(SM MHC、SM22)的标志。3、筛选后的CD34+细胞经PDGF-BB或VEGF诱导7天后,培养物中均可见SMMHC和CD31阳性细胞；但在PDGF-BB诱导的细胞中,SM MHC阳性细胞较CD31阳性细胞明显占优势,而在VEGF诱导的细胞中则反之。结论：1)SD雌性大鼠动脉壁的外膜存在CD34+ VRS/Pcs,且老年雌性大鼠动脉壁VRS/Pcs数量显著减少；2)“外膜组织爬片结合磁珠分选”法可获得纯度较高的CD34+ VRS/Pcs;3)分离、筛选后的CD34+ VRS/Pcs具有向SMC和内皮细胞分化的潜能。第二部分：雌激素对CD34+ VRS/Pcs增殖及向SMC定向分化的影响目的：观察雌激素对体外培养CD34+ VRS/Pcs的增殖及其向SMC定向分化的影响。方法：采用BrdU掺入法及流式细胞术分析不同浓度(0,10-10,10-8mol/L)…雌二醇(E2)对生长于干细胞培养基(含LIF)中的CD34+ VRS/Pcs增殖的影响；采用免疫细胞化学法及流式细胞术检测E2(10-8mol/L)对PDGF-BB-诱导的CD34+ VRS/Pcs向SMC分化的影响。结果：1、在干细胞培养基中培养的CD34+ VRS/Pcs生长到第3天(进入对数增长期)时,E2显著促进细胞的BrDU掺入率,且这一效应呈剂量依耐性。流式细胞仪分析显示：E2使G0/G1期的细胞数显著减少、S期和G2/M期细胞增多,从而导致CD34+ VRS/Pcs复制指数(RI)显著增高。E2的这种加速细胞周期进程的作用也呈浓度依赖性。2、免疫细胞化学检测提示：PDGF-BB诱导7天后,与0 mol/L E2组相比,10-8mo1/LE2组SM22阳性(绿色荧光标记)细胞数明显增多；进一步流式细胞术定量分析证实,10-8mol/L E2组SM22阳性细胞率可达92.33士1.94%,而0 mol/LE2组为78.20士2.19%,二者间的差异具有统计学显著性意义。结论：雌激素对CD34+ VRP/Pcs的效应具有双重性：1)当CD34+ VRP/Pcs处于低分化状态时(在干细胞培养基中生长),雌激素通过加速细胞周期进程促进其增殖；2)当CD34+ VRP/Pcs被诱导向SMC定向分化时(在PDGF-BB刺激下),雌激素促进其分化。第三部分：雌激素-促进CD34+ VRS/Pcs增殖及分化的双重效应机制目的：以SMC增殖和分化的关键调控环节myocardin, Elkl与SRF的相互作用为契入点,探讨雌激素对CD34+ VRS/Pcs增殖及分化的双重效应机制。方法：1、qRT-PCR及Western B lot定量分析不同培养条件(干细胞培养基或PDGF-BB诱导培养基)下,雌激素对CD34+ VRS/Pcs增殖及分化相关调控分子SRF,p-Elkl, Elkl, c-fos, myocardin, SM22及ER～, ER二种雌激素受体表达的变化。ChIP法检测myocardin-SRF或pELK1-SRF复合物分别与SM22及c-fos基因中CArG盒的结合率,并分析其与myocardin, SM MHC, c-fos的表达的关系。2、对PDGF-BB诱导的CD34+ VRS/Pcs, Western blot检测在有或无E2情况下SRC3蛋白的表达,IP方法检测myocardin与SRC3结合的改变。结果：1、RT-qPCR和Western blot分析显示：当生长于干细胞培养基中时,CD34+ VRS/Pcs可表达SRF, pELK1, myocardin, c-fos, SM22, ER～和ER…；加入10-8mol/L E2可显著促进SRF,pELK1和c-fos的表达,但对myocardin和SM22无明显影响。当细胞处于PDGF-BB诱导培养基中时,SRF, myocardin和SM22的表达升高,但pELK1和c-fos的表达降低。加入10-8 mol/L E2可显著促进I]nyocardin和SM22的表达,对SRF、pELK1和c-fos无明显影响。2、ChIP分析显示,当CD34+VRS/Pcs在干细胞培养基中生长时,E2显著促进pELK1-SRF复合物与c-fos基因CArG盒的结合,但对myocardin-SRF复合物与SM22基因的结合无明显影响；相反,在PDGF-BB诱导培养条件下,E2对pELK1-SRF复合物与c-fos基因的结合无明显影响,但大幅增力myocardin-SRF复合物与SM22基因启动子的结合。E2的这一作用能够被雌激素受体阻断剂ICI182,780阻断。3、Western blot及P检测显示,当CD34+ VRS/Pcs处于SMC诱导培养基中时,10-8mol/L E2能够上调SRC3的表达,并促进SRC3-myocardin复合物的形成,且这一作用能够被雌激素受体阻断剂1CI 182,780阻断。结论：对于不同状态的CD34+ VRS/Pcs,雌激素通过影响myocardin、E lk1与SRF相互作用而发挥其双重效应：1)当细胞处于未分化状态时,雌激素通过增强pELK1-SRF复合物与c-fos基因的启动子结合而促进细胞增殖；2)当细胞被诱导向SMC分化时,雌激素通过ER共激活因子SRC3与myocadin的相互作用,加强yocardin-SRF复合物与SM22基因的结合而促进细胞分化。