肝纤维化是慢性肝损伤发展为肝硬化的病理过程,我国肝纤维化发病率高,严重危害国民健康。目前用于研究肝纤维化的动物模型主要通过化学药物来制备,而病原微生物感染模型方法甚少。据报道,肝螺杆菌感染可诱导小鼠慢性活动性肝炎、肝癌、肝胆肿瘤,而对其中间过程肝纤维化报导较少。本课题通过BALB/c小鼠感染肝螺杆菌来建立肝纤维化动物模型,并着眼于其病理特征和致病机制的初步探究。鉴于肝螺杆菌引起肝纤维化的机制尚不清楚,本研究在建立肝纤维化动物模型的基础上,通过腺病毒载体介导的肝细胞IL-33表达沉默,探究IL-33在肝螺杆菌致小鼠肝纤维化中作用机制,从免疫学、组织病理学、分子生物学等多角度研究肝螺杆菌感染引起的肝脏损伤。1.肝螺杆菌感染BALB/c小鼠建立肝纤维化模型据文献报导,肝螺杆菌感染与慢性肝炎和肝癌有关。但其引起慢性肝炎向肝癌进展的分子机制仍不清楚,因此建立肝螺杆菌致BALB/c小鼠肝病模型,有利于了解肝疾病的发展进程。本研究中,分别于雄性BALB/c小鼠感染肝螺杆菌的8、12、16、20、24周,检测肝组织病理学、肝螺杆菌定植、信号通路蛋白和关键炎症因子的表达。结果表明感染肝螺杆菌7天便从小鼠粪便中检测出其DNA,而在感染8周以后肝脏中检测结果才呈阳性。HE染色和天狼星红染色显示肝螺杆菌引起的肝炎和肝纤维化随着感染时间延长而加重,感染24周时感染组小鼠肝病变发生坏死和硬化。肝螺杆菌感染可促使丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高。RT-PCR结果表明感染组小鼠肝白介素6、白介素1β、转化生长因子β和肿瘤坏死因子α的mRNA转录水平明显高于对照组小鼠。此外,STAT3、核因子κB(P65)、MAPK(Erk1/2和p38)和α-SMA蛋白可被肝螺杆菌激活。这些数据表明,肝螺杆菌感染雄性BALB/c小鼠可作为一个新的肝纤维化模型。2.干扰小鼠IL-33表达重组腺病毒载体的构建为探究IL33在肝螺杆菌感染致BALB/c小鼠肝纤维化中的作用,从NCBI基因库获得小鼠IL-33(mIL-33)基因序列并设计shRNA,腺病毒载体pDC316-ZsGreen1-shRNA经PstI和BamHI双酶切后与干扰RNA片段shIL-33连接构建腺病毒载体。将其与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293 A细胞,10天后收集细胞液上清获得第一代病毒,再经纯化浓缩至病毒滴度为1×1010 PFU/mL。将其尾静脉注射BALB/c小鼠,于接种24周后剖检取肝脏,一份用于提取蛋白进行免疫印迹检测,一份用于制作切片进行免疫组化,验证腺病毒干扰效率。结果表明,重组腺病毒载体pDC316-ZsGreen1-shIL-33经酶切验证以及测序结果均正确,包装腺病毒可表达GFP荧光蛋白,计算病毒滴度并通过浓缩以达到实验用量。蛋白免疫印迹和免疫组化的结果显示,腺病毒注射组小鼠IL-33表达水平明显低于对照组,且肝细胞中IL-33表达量减少。结果显示成功构的建腺病毒载体包装成腺病毒能干扰小鼠肝细胞IL-33表达,为后续研究IL-33在肝纤维化中作用机制打下基础。3.肝螺杆菌感染通过IL-33/ST2信号通路促进BALB/c小鼠的肝纤维化IL-33是一种参与炎症和纤维化疾病的细胞因子,但其与肝螺杆菌感染导致小鼠肝纤维化的致病机制尚不清楚。通过肝螺杆菌感染小鼠8周后,再给予IL-33重组腺病毒干扰其表达。所有小鼠均于感染24周时处死,收集所有小鼠的血清和肝组织。检测肝组织病理学、肝螺杆菌定植水平、信号通路激活和关键炎症因子在肝脏中的表达。免疫组化检测IL-33和生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的组织定位和表达水平。结果显示肝螺杆菌感染组小鼠肝脏中IL-33的表达水平明显升高。免疫组织化学分析显示,由于感染肝螺杆菌,IL-33由细胞核转移到细胞质且表达量增多。荧光定量PCR及组织病理学评价显示,IL-33表达的下调可减轻肝螺杆菌引起的肝纤维化以及炎性因子的表达。此外,肝螺杆菌激活细胞表面受体ST2,ST2的活化又激活核因子κB(P65)、α-SMA、Erk1/2。其结果为肝螺杆菌引起的肝纤维化和肝炎发病机制提供新的见解。