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最近我们证实了新合成的黄酮类化合物LL-202对人乳腺癌细胞显示出较强的体体外抗肿瘤效应。其抗肿瘤活性的潜在机制还有待阐明。半胱氨酸蛋白水解酶(caspases)的激活是细胞凋亡的一个主要标志，表现为对细胞死亡的起始因子和执行因子的活化。细胞周期依赖性蛋白激酶与细胞周期依赖性激酶抑制剂之间的平衡严密调控细胞周期的进程，各种生长抑制和生长刺激的转导信号所形成的复杂网络对这个平衡起着调节作用。在本研究中，我们主要探讨了LL-202诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和周期阻滞作用及其相关机制。 一、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用的研究 通过对几种常见肿瘤细胞的增殖抑制研究，发现人乳腺癌MCF-7细胞是对新化合物LL-202最敏感的细胞株。进一步研究LL-202对体外培养的乳腺癌MCF-7细胞生长的影响，计算出作用不同时间的IC50值，并绘制抑制率曲线。实验结果表明，LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用呈显著的时间和剂量依赖性。最终我们确定了LL-202后续体外实验的有效剂量及给药时间。光镜下观察，随着给药剂量的增加，MCF-7细胞出现了体积缩小，细胞膜皱缩，细胞变圆，漂浮，甚至细胞破裂。 二、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用的研究 1、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用的影响 采用DAPI染色和流式双染技术检测LL-202对MCF-7细胞的凋亡诱导作用。DAPI染色的结果从形态学上显示出，随着给药剂量的增加，MCF-7细胞出现了核固缩或破裂，凋亡小体出现等经典细胞凋亡的现象。而Annexin-Ⅴ/PI双染的结果进一步证实LL-202诱导的细胞凋亡。 2、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞线粒体膜电位的影响 采用JC-1荧光染料检测细胞MMP。LL-202可以使MMP发生改变，并且具有明显的浓度依赖性。随后我们通过Western Blotting实验发现LL-202使细胞色素C从线粒体释放到胞浆中，与Apaf-1结合后启动Caspases级联反应最终导致细胞凋亡。 3、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞内活性氧的影响 采用活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS水平。结果显示，LL-202可以使细胞内ROS含量增加，且呈浓度依赖性。与LL-202组相比，ROS抑制剂NAC与LL-202联合应用组部分降低了细胞内ROS含量。之前AnnexinⅤ/PI双染实验结果也发现了NAC能够明显降低LL-202对细胞的凋亡诱导作用。 4、LL-202对细胞凋亡相关蛋白的影响采用Western Blot实验，考察LL-202对凋亡相关蛋白表达的影响。结果表明，LL-202可诱导caspase-9、caspase-8的激活以及切割PARP。同时，LL-202可上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抑凋亡蛋白Bcl-2和Bid的表达。 三、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞周期阻滞作用的研究 1、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞周期阻滞作用的影响 通过PI流式单染技术，研究LL-202对MCF-7周期阻滞作用。结果表明，LL-202作用后G2/M期细胞百分率随剂量升高而大幅增加，并伴随着G0/G1期细胞的减少。同时，相比较于control组的G2/M期细胞百分率随时间的延长而降低，给药组的细胞则一直阻滞在G2/M期。 2、LL-202对细胞周期相关蛋白的影响 采用Western Blot实验，考察LL-202对G2/M期相关蛋白的影响。结果表明，给药后，cyclin B1、cyclin A、cyclin H、CDK7、p-CDK1(Thr161)、Cdc25c和CDK1的蛋白表达下调，p21和p-CDK1(Thr14/Tyr15)的表达上调，并呈时间和剂量依赖性。 四、LL-202对裸鼠移植瘤模型的肿瘤抑制作用的研究 1、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞裸小鼠异种移植瘤模型抑制作用及安全性评测 建立了人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠异种移植瘤模型，结果发现给予15、7.5、3.75mg/kg的LL-202以及150 mg/kg Wogonin后肿瘤抑制率分别为69.22％，53.33％，45.64％和73.03％。同时，在对裸小鼠体重、外周血和五大脏器的安全性评价研究中发现，LL-202组实验动物的体重没有明显的变化，并且在给药过程中没有出现实验动物死亡的现象，各组外周血指标和脏器HE染色都在标准范围内。 2、LL-202对人乳腺癌MCF-7细胞裸小鼠异种移植瘤抑制作用初步机制研究 TUNEL实验结果显示，LL-202能够引起MCF-7移植瘤凋亡作用，免疫组化检测周期相关蛋白表达也发现，LL-202在体内同样能够引起MCF-7移植瘤周期阻滞作用。 五、结论 通过大量的体内体外实验，我们发现LL-202在人乳腺癌MCF-7细胞中显示出了良好的抗癌活性。LL-202通过内源性线粒体凋亡通路以及外源性死亡受体通路诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。此外，LL-202也可引起MCF-7细胞产生G2/M期周期阻滞作用。