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烟草是典型的喜钾作物。钾不仅从多个方面参与烟草的生长发育,还作为重要的品质元素,调节烟草的生理生化反应,影响烟叶的品质、燃烧性和烟制品的安全性。烟草对K~+的吸收主要由钾通道和钾转运体介导。Shaker家族钾通道是研究最早、最为深入的一类钾通道。挖掘烟草关键Shaker钾通道基因,解析其在钾素营养过程中的功能和调控机制,对烟草的高钾遗传改良具有重要意义。本研究分别以林烟草(Nicotiana sylvestris)Shaker钾通道NsylNKT6和绒毛状烟草(N.tomentosiformis)Shaker钾通道NtomSKOR1为研究对象,通过生物信息学分析、组织化学染色和过表达材料的表型鉴定等试验,对两个基因在钾吸收转运方面的功能进行初步探究。为明确NsylNKT6的组织表达模式,对该基因启动子序列进行了顺式作用元件预测。结果表明,NsylNKT6启动子含有光响应元件、植物激素响应元件(脱落酸、乙烯和赤霉素等)、胁迫响应元件(厌氧、干旱、抗病和伤口等)和分生组织表达元件等,推测该基因的表达可能受到光、激素和胁迫等多种环境信号的调控。进一步获得了NsylNKT6启动子驱动GUS报告基因的转基因材料。组织化学染色结果表明,GUS活性主要在烟草苗期叶片的保卫细胞和团棵期叶脉维管组织、叶片的腺毛及保卫细胞中检测到,表明NsylNKT6在上述组织中发挥功能。利用酵母异源表达体系,对前期获得的NsylNKT6两个不同克隆编码蛋白(NsylNKT6-1和NsylNKT6-2)的钾吸收活性进行了检测。结果显示,NsylNKT6-1无钾吸收功能,NsylNKT6-2能很好地回补钾吸收缺陷型酵母在低钾培养基上的生长,具有与拟南芥Shaker钾通道AKT1相似的K~+内向转运能力。进一步生物信息学分析表明,NsylNKT6两个蛋白间的功能差异可能由第187位和第398位氨基酸的性质不同导致。通过转基因、自交和抗性筛选获得了拟南芥过表达NsylNKT6纯合材料,通过水培试验对其在不同供钾水平下的K~+积累水平进行了测定。结果显示,在低钾(0.1 mM K~+)和正常供钾条件(1.00 mM K~+)下,拟南芥过表达材料的长势和根部钾含量均显著高于野生型,表明NsylNKT6促进了拟南芥的K~+吸收和生长。基于上述研究,推测NsylNKT6可能作为重要的内向Shaker钾通道,通过调节K~+吸收参与调控气孔运动或介导维管组织的K~+吸收转运和腺毛的生长发育。从绒毛状烟草中克隆获得长2439 bp的NtomSKOR1启动子,对该启动子进行了顺式作用元件预测。结果表明,该启动子含有光响应元件、植物激素响应元件(脱落酸、生长素、水杨酸和茉莉酸等)、胁迫响应元件(厌氧、干旱、低温、抗病和伤口等)和胚乳表达元件等。进一步克隆获得全长为2484 bp的NtomSKOR1 CDS序列。生物信息学分析表明,NtomSKOR1蛋白属于Shaker家族Group V,预测其含有5个跨膜区,并具有Ion trans、cNMP binding、Anky、KHA保守结构域和Shaker钾通道保守基序TxxTxGYGD。构建了NtomSKOR1的亚细胞定位载体,利用瞬时表达试验分析了其亚细胞分布情况。结果表明,NtomSKOR1蛋白主要定位于细胞膜。推测NtomSKOR1可能作为膜定位的外向Shaker钾通道,参与细胞的K~+外流。研究进一步获得了ProNtomSKOR1::GUS转基因烟草材料和过表达NtomSKOR1的烟草材料,为后续工作奠定了材料基础。