为了进一步了解肌红蛋白Mb表面第60位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能以及与Cu²⁺相互作用的影响,本论文以含有编码马心肌红蛋白双突变位点（第44位和60位天冬氨酸突变为赖氨酸）基因的表达质粒pGYM为模板,设计特异性突变引物,通过PCR定点突变的方法将第44位的碱性氨基酸赖氨酸（K）密码子突变成酸性氨基酸天冬氨酸（D）密码子,获得肌红蛋白突变体D60K的基因。将带有突变体的目的基因克隆连接到表达质粒pGYM上,经热激转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌培养使突变蛋白D60K大量表达,收集菌体,酶法裂解细菌,并依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白,其纯度可达96%。用圆二色谱和紫外-可见吸收光谱法分别研究野生型肌红蛋白Mb（WT）及突变体（D60K）的耐热、耐酸及耐盐酸胍诱导的变性过程,结果表明:用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp60,降低了肌红蛋白的耐热能力,导致其热变性中点温度Tm由68.1℃降低到66.4℃;提高了肌红蛋白的耐酸变性和耐盐酸胍变性能力,导致其变性中点（pH）_1/2从4.32降到4.19、盐酸胍变性中点浓度Cm从1.95mM提高2.10mM。在研究突变位点对肌红蛋白与Cu²⁺相互作用的影响时,综合运用了紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱以及圆二色光谱。紫外-可见吸收光谱研究表明:Cu²⁺使Mb（D60K）的紫外吸收增强,峰位蓝移,疏水基团之间的作用力减弱;荧光光谱研究表明:Cu²⁺与Mb（D60K）相互作用时形成1:1的复合物且其猝灭机制属于静态猝灭,并由Van’t Hoff方程计算的ΔH、ΔS判断出二者之间的作用力主要表现为静电力,另外依据F（o|¨）rster非辐射能量转移理论计算出给体-受体间的结合距离为2.48 nm;同步荧光光谱研究表明,Cu²⁺使Mb（D60K）色氨酸残基的疏水性下降;CD光谱研究表明:加入Cu²⁺后,蛋白α-螺旋含量降低。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb（WT）和Mb（D60K）的过氧化物酶活性,结果表明:Mb（D60K）的Km为2.19mM而Mb（WT）的Km为1.26mM。Mb（WT）和Mb（D60K）作为过氧化物酶的最适反应温度均为60℃左右,在相同温度下,Mb（D60K）的过氧化物酶活性低于Mb（WT）,且其作为过氧化物酶的热稳定性低于Mb（WT）。此外,两者作为过氧化物酶的最适反应pH均在5.5左右。