斑马鱼ANO1蛋白的基因克隆、真核表达及细胞功能初鉴

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钙激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一类在多种细胞中广泛表达的阴离子通道蛋白,并介导一系列重要的生理功能。本研究以斑马鱼受精卵为实验材料,通过PCR的方法成功克隆得到斑马鱼ANO1(zeb-ANO1)基因CDS区序列,并利用生物信息学手段对其进行了系统分析,选取了22个不同物种的ANO1氨基酸序列进行了同源性分析,使用N-J法建立了物种进化树。构建了zeb-ANO1的慢病毒过表达载体,稳定转染至Fisher大鼠甲状腺上皮(FRT)细胞,分别在mRNA和蛋白水平上检测了其过表达效率。通过qPCR、Western blot的方法检测了zeb-ANO1蛋白在斑马鱼各组织中的分布情况;利用免疫荧光实验检测了zeb-ANO1蛋白在细胞中的表达与定位情况。通过短路电流实验测定了zeb-ANO1蛋白的电生理学特性,同时验证了CaCCs的抑制剂和激活剂对zeb-ANO1活性的影响。生物信息学预测结果显示,zeb-ANO1蛋白氨基酸序列全长925aa,具有9次跨膜结构;含有多个活性功能位点,包括磷酸化位点、糖基化位点等;zeb-ANO1蛋白的跨膜区域多为α-螺旋构象,组成螺旋桶状;不同物种ANO1蛋白的跨膜域保守性较高,N端和C端的胞内域变化较大;ANO1蛋白的进化过程与生物学物种进化相符。实验结果表明,zeb-ANO1蛋白在斑马鱼的心脏、肝脏、肾脏、腮腺、肠道、脾脏、肌肉中均有表达,其中在肾脏、腮腺、肠道、脾脏这些具有液体分泌功能的组织中表达量更高;zeb-ANO1的慢病毒真核过表达载体被构建成功,并获得稳定转染的FRT细胞;zeb-ANO1蛋白主要定位在细胞膜和细胞质;其蛋白活性由钙离子激活,CaCCs的经典抑制剂CaCCinh-A01和ANO1激活剂Eact对zeb-ANO1活性的影响与已验证的其他CaCCs通道相似。综上,斑马鱼ANO1蛋白在分子结构和功能表达等诸多方面均与现已知的其他物种ANO1蛋白相似,因而认为zeb-ANO1蛋白的分子功能也是CaCC。本研究首次将ANO1蛋白及其分子身份研究从较原始的两栖类前推至更原始的硬骨鱼类,为ANO1蛋白及其分子身份的进化研究奠定了实验基础并提供了理论线索。
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