猪胃蛋白酶是一种酸性水解酶,在饲料、食品、皮革、医药等方面有着广泛应用。本文将来源于猪的胃蛋白酶基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组上,并在毕赤酵母中成功表达。在摇瓶水平下,通过发酵条件优化,猪胃蛋白酶在BMGY-1培养基中扩大培养,在添加甲醇至终浓度为2.5%的BMMY-1培养基中诱导表达,第9 d达到最大酶活2322 IU/mL。产猪胃蛋白酶毕赤酵母菌株10 L发酵罐扩大培养,猪胃蛋白酶酶活最高达到11388 IU/mL,较摇瓶发酵酶活提高了 4.9倍。转运核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA(稀少tRNA)丰度改变对外源基因表达量的影响,本文构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了 4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了 12.5%;应用同样方式将tRNACCGPro基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了 21.3%。可见,tRNACCGPro在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNACCGPro基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,本文构建的共表达体系将同样适用于其他稀少tRNA基因的筛选和验证。同时,验证得到添加tRNA共表达在基本培养基中诱导表达比在丰富培养基中诱导表达优势更加明显。