登革病毒(dengue virus, DENV)隶属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)病毒,是一类经蚊媒传播的、有包膜的RNA病毒。我国境内几乎每年都有数百例感染登革病毒的病例报告,该病毒可使人和动物患病,其感染特点是患病率高但治愈率却比较低,人感染后易给人带来一些严重的后遗症,严重威胁人类健康。且登革类疾病临床上也缺乏有效的抗病毒药物,因此该类病毒感染的早期诊断及新型疫苗研发对有效控制登革类黄病毒疫情的传播尤为重要。已有研究结果表明,以登革等黄病毒基因组RNA为基础的复制子载体技术已广泛用于新型疫苗研发、抗病毒药物筛选等应用研究领域,在病毒复制和翻译的调控分子机制等基础研究也得到了广泛的应用。登革病毒的基因组长约11kb,属于包膜的单股正链RNA病毒,由5’和3’非编码区(untranslated region,UTR)及中间单一的开放读码框组成(open reading frame,ORF),其中开放读码框编码三个结构蛋白(C. prM/M、E)和七个非结构蛋白(NSI、NS2A、 NS2B、 NS3、 NS4A、 NS4B和NS5)。结构蛋白主要参与病毒的组装过程,非结构蛋白及5’和3’UTR在病毒RNA的复制和翻译的起始及调控起重要作用。RNA复制子基于相应病毒全长感染性克隆技术,将病毒复制和翻译必不可少的重要顺式作用元件(包括5’和3’UTR、全部病毒非结构蛋白基因和部分必要的病毒结构蛋白基因)保留,其缺失了大部分结构蛋白基因或由外源基因替代构构建的病毒复制子。本研究在登革病毒4型感染性cDNA克隆p4上删除病毒大部分结构基因prM-E,构建了登革病毒复制子载体p4-△prME。为验证复制子载体的包装功能,将红色蛋白报告基因mCherry克隆至复制子载体p4-△prME构建工程载体p4-△prME-mCherry,同时构建缺失RNA依赖RNA聚合酶(RDRP)核心序列GDD的缺陷型复制子载体p4-△prME-mCherry-△GDD。体外转录和细胞转染实验结果显示,源自p4-△prME-mCherry的转录体RNA转染Vero细胞后可持续呈现特异性的红色荧光,且在转染后24h-96h可形成稳定的信号峰。与之相比,缺失RDRP核心序列GDD的缺陷型复制子载体在转染细胞后无特异红色荧光出现。以上研究结果表明,我们所构建复制子载体p4-△prME可成功表达红色荧光蛋白报告基因,这为目标基因表达、重组病毒颗粒制备等奠定了基础。RNA型复制子载体的启动子为原核启动子T7、SP6等,在实际应用过程中需要进行体外转录操作,但是体外转录试剂盒有操作繁琐且价格昂贵等缺点。相比而言,质粒DNA型复制子载体可通过真核启动子(如CMV、SV40等)在宿主细胞内启动载体的转录,因此,质粒DNA型复制子载体无需像RNA型复制子载体的体外转录,而是可将复制子载体导入细胞中,从而高效稳定表达外源基因。鉴于此,本研究以登革病毒4型感染性克隆p4质粒为基础,将改造后的病毒复制和翻译必需的顺式作用元件和NS5的部分关键序列插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的CMV启动子下游,构建了DNA型微复制子载体pcDEN-△prME。为验证微复制子载体的包装功能,将定性的绿色荧光蛋白报告基因和定量的海肾荧光素酶基因分别克隆至pcDEN-△prME构建工程载体pcDEN-△prME-EGFP和pcDEN-△prME-GLUC。转染实验结果显示,微复制子载体可成功表达绿色荧光蛋白报告基因及海肾荧光素酶报告基因。本研究以登革病毒4型感染性cDNA克隆p4为分子基础,分别构建了RNA型复制子载体p4-△prME和DNA型微复制子载体pcDEN-△prME,两者均可成功表达报告基因等外源基因。尤其是DNA型微复制子载体在保留病毒必要的顺式作用元件和NS5部分关键序列的同时缺失了大部分非结构基因,使得该载体在简化实验操作的同时大大提高了病毒载体的容量。以上登革病毒复制子载体的构建为深入研究以登革为代表黄病毒抗病毒药物筛选和新型疫苗研发提供了有力工具,更为病毒复制及翻译的分子调控机制提供了新的技术平台。