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GRK5是G蛋白偶联受体激酶（GRKs）家族的一个成员,它主要磷酸化生物体中最大的一类跨膜受体G蛋白偶联受体（GPCRs）,能够介导受体的失敏,调节信号的转导,在组织分化、疾病发生过程中具有重要的作用。有研究显示GRK5在甲状腺分化癌、高血压、心力衰竭、阿尔默海茨病、帕金森病、记忆功能及药物成瘾中具有非常重要的作用。但对GRK5在这些疾病中的具体作用不是很清楚,已有的研究大都是通过相关的动物模型来探讨GRK5的具体功能。动物模型的优点是:临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来、可以严格控制实验条件,增强实验材料的可比性、有助于更全面地认识疾病的本质;缺点是:费时、费力、一个周期较长。基因克隆技术使得真核基因能在原核表达系统中表达,蛋白的纯化也比较容易,这给研究蛋白的功能活性带来了方便。而原核表达具有操作方便、快捷,需时较短,表达量大,适合工业化生产等优点。通过基因克隆技术可将GRK5基因转入原核表达系统中进行表达,并对GRK5蛋白的表达进行检测,并且蛋白的纯化比较方便,这对后续蛋白性质的研究奠定基础。本论文就SD大鼠GRK5在大肠杆菌中的表达进行以下的研究。1、GRK5基因的扩增、克隆和序列分析根据GeneBank数据库公布的SD（Sprague-dawley）大鼠GRK5的基因序列,设计GRK5基因的特异性引物,从SD大鼠组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到GRK5基因,限制性酶双酶切后克隆到pBluescriptⅡSK（+）载体上,送交测序公司测序,得到GRK5的核苷酸序列,并与GeneBank数据库上公布的SD大鼠GRK5基因序列进行比对,比对结果显示GRK5基因克隆成功。2、GRK5-GST重组蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta-gami（DE3）中的表达及优化将GRK5基因重组到pGEX-4T-1载体上,转化到大肠杆菌E.coli Rosetta-gami（DE3）中诱导表达,在OD600为0.6,IPTG终浓度为0.3mM,37℃,诱导4h,经过SDS-PAGE分析,证实GRK5-GST重组蛋白表达成功。将pGEX-4T-1/GRK5重组载体转化大肠杆菌E.coli Rosetta-gami（DE3）中,进行正交试验优化表达,在IPTG浓度为0.3mM、0.5 mM、0.7 mM、0.9 mM,诱导温度为25℃、28℃、30℃、37℃分别下诱导3h、4h、5h、6h,收菌,超声破碎,经过SDS-PAGE和ELISA分析,表达量没有变化,且表达水平低,这可能是由于多种原因造成的,如:稀有密码子、真核基因在原核表达系统中的表达低等。3、GRK5的ELISA方法检测本实验中,GRK5的样品与包被液按1:2的比例稀释;GRK5多克隆抗体按1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000比例的浓度稀释,优化一抗工作浓度;HRP标记的羊抗兔二抗按说明书推荐的最佳比例1:500的浓度稀释,同时设置空白和阴性对照。正式试验采用GRK5的样品与包被液按1:2的比例,优化的一抗工作浓度1:700,二抗1:500,450nm测吸光值,计算出S/N的值,检测GRK5的表达水平,ELISA结果表明:GRK5蛋白在E.coli Rosetta-gami（DE3）中成功表达。