硬膜外纤维化是椎板切除术后发生的较为常见的并发症,主要症状为疼痛再发,严重影响着患者术后的生活质量,是困扰骨科医师的难题之一。目前预防及治疗措施虽然众多,但只能一定程度上预防硬膜外纤维化的发生,不能有效根治。硬膜外纤维化的发生机制是一个复杂的过程,迄今为止的研究发现,手术后术区成纤维细胞的活化增殖,形成大量瘢痕组织是导致这一并发症的主要原因,它可以引起硬膜囊和神经根的广泛粘连,从而发生硬膜外纤维化,导致患者剧烈疼痛。自噬是当前的研究热点之一,现在人们将自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三种,一般意义上的自噬指的是巨自噬。自噬这一过程极为保守,其对生物的正常发育及生命活动极为重要,同时,自噬的失调可以与很多疾病相关,包括肿瘤、退行性疾病、感染等。目前发现,其在纤维化疾病的发生发展过程中也发挥了极为重要的作用。青蒿琥酯(Artesunate,ART)是一种提取自青蒿素的抗寄生虫药,临床上常常被用来治疗疟疾。近来研究发现,青蒿琥酯对于纤维化疾病的发生发展具有良好的预防及治疗作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路是一个重要的真核细胞通路,可以参与到免疫抑制过程中,在细胞的增殖、凋亡以及自噬的发生过程中也发挥了重要的作用。本研究拟探讨m TOR信号通路介导的自噬途径在青蒿琥酯预防硬膜外纤维化疾病发生过程中的作用,以期可以为临床工作中硬膜外纤维化的防治工作提供潜在的治疗靶点,提高患者的手术效果,提升他们的日常生活质量。第一章青蒿琥酯预防大鼠硬膜外纤维化的研究目的:探索青蒿琥酯预防大鼠硬膜外纤维化的效果,并研究其可能的机制。方法:选取72只成年SD大鼠,雄性,将它们随机分为四组,分别是15、30、60 mg/kg ART组和生理盐水组,建立大鼠硬膜外纤维化模型。饲养4周后,首先对大鼠进行大体观察,测量Rydell评分。随后处死大鼠,取术区的瘢痕纤维化组织标本,检测术区标本之中羟脯氨酸的含有量,同时进行免疫荧光检测波形蛋白、成纤维细胞表面蛋白等,对术区细胞进行鉴定,观测成纤维细胞状态;以HE染色观察大鼠硬膜外纤维化粘连的程度并进行成纤维细胞计数;以天狼星红染色、Masson染色比较标本中胶原的含量;以免疫组织化学检测LC3、PCNA、Cyclin D1、p-m TOR的表达量。结果:1.实验中所有SD大鼠均恢复良好,没有出现死亡、术区感染、伤口不愈合等情况。2.Rydell评分发现ART组硬膜外纤维化粘连程度减轻。3.免疫荧光染色检测术区波形蛋白、成纤维细胞表面蛋白,结果发现波形蛋白和成纤维细胞表面蛋白大量阳性表达,说明在我们手术之后的术区里有大量成纤维细胞生长。4.HE染色低倍镜下观察,发现ART可以使硬膜外纤维化程度减轻,且呈明显的浓度依赖性;高倍镜下进行成纤维细胞计数,发现应用ART后,成纤维细胞的数量相较对照组而言显著降低,并且60 mg/kg组成纤维细胞数量较15 mg/kg组和30 mg/kg组少,30 mg/kg组较15mg/kg组少。5.羟脯氨酸测定、天狼星红染色及Masson染色结果显示,实验组胶原含量及密度较对照组明显降低,同样呈浓度依赖性。6.免疫组织化学检测术后标本内PCNA、Cyclin D1、p-m TOR和LC3的表达量,发现实验组中前三者含量较对照组均低,呈浓度依赖性,而LC3则随着浓度的增高而增高。结论:1.不同浓度的ART处理大鼠后,大鼠没有出现死亡、术区感染、伤口不愈合不良并发症,提示ART在预防大鼠硬膜外纤维化的发生中具有比较良好的安全性。2.实验中,成纤维细胞参与了损伤的修复过程。不同浓度的ART可以通过抑制术区成纤维细胞的增殖、减少术区胶原组织的产生从而发挥预防硬膜外纤维化的作用,并且这种作用呈浓度依赖性。3.ART能够使LC3表达增高而p-m TOR的表达量降低,提示自噬和mTOR信号通路参与了ART预防硬膜外纤维化的过程。第二章青蒿琥酯诱导成纤维细胞自噬并抑制其增殖目的:研究青蒿琥酯抑制成纤维细胞增殖的可能机制。方法:我们将成纤维细胞进行实验室内的培养,当培养所得的细胞其密度达到60%-80%时,采用不同浓度ART作用24h和特定浓度(10μM)ART的作用不同时间的方式进行药物干预,用倒置荧光显微镜观察,通过CCK-8检测成纤维细胞活力,并通过Ed U染色、western-blot检测PCNA和Cyclin D1,观察ART对成纤维细胞增殖的影响。同时,通过LC3免疫荧光染色,自噬相关蛋白(Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,Atg5和p62)的western-blot检测和透射电镜观察ART对成纤维细胞自噬的影响。最后,用自噬抑制剂3-MA处理成纤维细胞,通过CCK-8、western-blot检测自噬被抑制后ART对于成纤维细胞增殖能力抑制作用的变化。结果:1.CCK-8测试结果表明,随着ART药物浓度的上升,以及ART作用时间的延长,检测到成纤维细胞其活力不断的降低,显示出明显的时间和浓度依赖性。2.将成纤维细胞用特定浓度(10μM)的ART处理后,使用Ed U染色检测细胞中的DNA合成。结果表明ART可以显著地对成纤维细胞的DNA合成能力发挥抑制效果。3.ART用于干扰成纤维细胞,western-blot用于检测与增殖有关的蛋白质。结果表明,PCNA和Cyclin D1随浓度增加和时间的延长而降低,这种降低的趋势表现出浓度以及时间依赖性。4.LC3免疫荧光染色结果显示,ART干预后,成纤维细胞中的荧光斑点数量增加,表明自噬体数量增加,自噬增强。5.ART用于干预成纤维细胞,western-blot检测到自噬相关蛋白。结果表明,Beclin-1,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atg5的表达随着ART浓度的增加以及时间的延长而增加,而p62的表达随着ART浓度的增加以及时间的延长而减少,这进一步说明ART诱导自噬,并呈浓度和时间依赖性。6.通过透射电镜观察ART干预后的成纤维细胞,发现自噬体大量出现,这充分证明ART可以诱导成纤维细胞自噬。7.3-MA作用后,LC3免疫荧光染色及western-blot检测LC3表达结果显示,ART引起的成纤维细胞自噬可以被部分逆转。8.3-MA作用后,CCK-8检测及western-blot检测增殖相关蛋白,结果显示,成纤维细胞自噬受到抑制后,ART对成纤维细胞活力以及对于增殖能力的抑制作用减轻了。结论:1.ART能有效抑制成纤维细胞的活力,其抑制作用取决于时间和浓度。2.ART可以对成纤维细胞的增殖能力发挥有效的抑制作用,并且还表现出明显的浓度和时间依赖性,这表明ART可能通过抑制成纤维细胞的增殖来抑制其生存能力。3.ART可诱导成纤维细胞自噬,其作用是浓度和时间依赖性的。4.ART可以通过诱导成纤维细胞发生自噬从而抑制其增殖。第三章m TOR介导的自噬途径在青蒿琥酯抑制成纤维细胞增殖中的作用目的:研究m TOR介导的自噬途径在ART抑制成纤维细胞增殖中的作用。方法:成纤维细胞在体外培养。当细胞密度达到60%-80%时,以不同浓度(0、5、10、20μM)进行ART药物干预24小时,并且以western-blot法检测m TOR下游相关蛋白和上游PI3K/AKT和AMPK信号通路相关蛋白,包括p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,p-AMPK,AMPK,p-m TOR,m TOR,p-4E-BP1和p-P70S6K,通过这些蛋白的变化来确定m TOR信号途径是否参与ART的作用。过表达m TOR构建稳定的细胞系,并通过western-blot检测过表达的效果。对照组和过表达的成纤维细胞接受或不接受ART干预,然后进行LC3免疫荧光染色和自噬相关蛋白(LC3,Atg5,p62)的western-blot检测,并观察ART对m TOR介导的自噬途径的影响。对照组和过表达的成纤维细胞均接受或不接受ART干预,使用CCK-8,Ed U染色和western-blot检测增殖相关蛋白(PCNA,Cyclin D1),以确定ART是否通过m TOR介导的自噬影响了成纤维细胞的增殖功能。结果:1.用不同浓度(0、5、10、20μM)的ART处理成纤维细胞后,检测到m TOR的下游和上游信号通路蛋白。结果显示,ART抑制了m TOR激活途径PI3K/AKT,而激活了抑制m TOR信号的AMPK通路,两条信号传导途径以浓度依赖性的方式被激活,而当m TOR被抑制时,自噬增强。2.m TOR过表达后,LC3免疫荧光染色显示ART干预后成纤维细胞中的囊泡数量减少,western-blot实验结果显示自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Atg5的表达较ART干预后的对照组减少,p62较ART干预后的对照组表达增加,趋势已部分逆转。3.在m TOR过表达后,CCK-8测试发现ART抑制成纤维细胞活力的效果减轻。Ed U染色结果表明ART抑制成纤维细胞DNA合成的能力减轻。Western-blot试验显示,增殖相关蛋白(PCNA,Cyclin D1)的下降趋势被部分逆转。结论:1.m TOR介导的信号通路参与了ART干预成纤维细胞的作用过程。2.ART通过m TOR介导的途径影响成纤维细胞自噬。3.ART通过m TOR介导的自噬途径抑制成纤维细胞增殖。