目的:通过观察清热解毒、凉血化瘀法联合骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭模型大鼠肝细胞凋亡的影响,从抑制细胞凋亡角度分析并进一步探索中药联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠的疗效机制与协同作用。方法:(1)采用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,并进行体外培养,镜下观察生长状态,并以流式细胞术进行表型鉴定,冻存及复苏以供移植备用。(2)取体重约为180g-220g清洁级SD大鼠共72只,随机选取6只进入空白组,剩余66只大鼠采用10%D-氨基半乳糖1.2 g/kg、0.005%脂多糖5μg/kg,依次相隔12h经腹腔注射制备急性肝衰竭大鼠模型,造模后即开始观察大鼠各项生理及病理状况,肝功能水平及肝脏病理组织观察,初步确定模型的建立。(3)造模后12h,采用数字分组法将存活大鼠分为模型对照组(后称模型组)、阳性对照组、中药干预组(后称中药组)、干细胞移植组(后称干细胞组)、干细胞移植联合中药治疗组(后称联合组)。干细胞组及联合组大鼠经门静脉注射干细胞悬液约1.2ml,其余各组给予等体积生理盐门静脉注射。其中联合组在干细胞移植同时给予茵陈四苓颗粒1.5g/(kg·次)灌胃,1日两次;中药组给予茵陈四苓颗粒1.5g/(kg·次)灌胃,1日两次,阳性对照组给予复方甘草酸苷15mg/kg灌胃,1日两次,其余各组给予等量生理盐水灌胃,直至处死大鼠。(4)计算治疗后48h、120h各组大鼠的生存率,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(ast)及总胆红素(tbil),比较给予治疗后各组大鼠肝功能的改善情况;he染色观察肝脏组织病理学改变,tunel染色观察肝细胞凋亡情况并计算凋亡指数,采用western-blot技术检测各组大鼠肝组织caspase-3蛋白相对表达水平,realtime-pcr技术测定各组大鼠肝组织中bcl-2mrna、baxmrna的表达水平。结果:(1)成功分离大鼠骨髓中原代细胞,经过贴壁纯化、传代培养后可获得p3代细胞,形态呈长梭形或扁平多角形,部分有伪足的细胞,呈旋涡状分布生长。经流式细胞仪分析,cd44、cd29分别高表达为98.2%、97.9%,cd45、cd34分别低表达为12.9%、18.7%,符合骨髓间充质干细胞表面标记物表达特征。(2)造模后6小时起,大鼠出现精神萎靡、嗜睡、食欲减退、个别出现惊厥抽搐等症状。模型组大鼠肝组织he染色可观察到大鼠肝组织可见片状坏死、出血和弥漫的炎症细胞浸润,肝索结构紊乱,肝小叶结构明显破坏,部分细胞可见空泡样变性,出现典型急性肝损伤,结合肝功能明显异常,提示成功建立急性肝衰竭模型。(3)模型建立后12h,死亡大鼠8只,剩余58只进入下一步实验,治疗后48h,模型组、阳性对照组、中药组、干细胞组及联合组各组大鼠存活率分别为45.5%、66.7%、72.7%、66.7%、72.7%;剩余大鼠全部存活至第5天,干预后120h,各组生存率依次为33.3%,、50%、63.6%、58.3%、72.7%;各组差异不具有统计学意义。(4)治疗后48h各组大鼠血清ast、alt、tbil水平与空白组比较明显异常,其中联合组与模型组及其他干预组比较,肝功能水平明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05);治疗后120h,与模型组比较,各干预组血清ast、alt、tbil水平明显降低且差异有统计学意义(p<0.05),其中以联合组效果最显著,并且优于单纯干预组(p<0.05)。(5)治疗后48h,tunel染色提示模型组大鼠肝组织可见大量肝细胞凋亡,中药组及联合组凋亡指数降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后120h,与模型组相比,各干预组大鼠干细胞凋亡指数降低且差异有统计学意义(P<0.05),联合组效果优于单纯干预组。(6)造模后48h、120h,模型组肝组织Caspase-3蛋白表达水平增高,且维持较高水平,各干预组Caspase-3蛋白表达均低于模型组,其中阳性对照组、中药组、干细胞组Caspase-3蛋白表达水平无显著差异(P>0.05),而联合治疗组Caspase-3蛋白表达最低,与其他干预比较差异有统计学意义(P<0.05)。(7)经治疗后48h、120h,各组大鼠肝组织中Bax mRNA的表达逐渐降低,Bcl-2 mRNA的表达逐渐升高,其中联合组大鼠肝组织中Bax mRNA的表达水平低于各对照组及治疗组,差异有统计学意义(P<0.05),Bcl-2 mRNA的表达水平高于各对照组及治疗组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)采用全骨髓贴壁培养法,经过三次贴壁纯化、传代培养,能够从SD大鼠骨髓中分离出较高纯度的P3代骨髓间充质干细胞。(2)间隔12h,依次经腹腔注射D-氨基半乳糖1.2 g/kg、脂多糖5μg/kg,能够成功建立大鼠急性肝衰竭模型,肝脏结构破坏明显,死亡率恰当。(3)茵陈四苓颗粒联合骨髓间充质干细胞移植,能够减轻急性肝衰竭模型大鼠肝功能损伤,抑制肝脏细胞凋亡,效果优于单用中药治疗或者单用干细胞移植治疗。(4)茵陈四苓颗粒可能通过下调肝脏组织Caspase-3蛋白的表达,调控凋亡基因Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达,协同骨髓间充质干细胞发挥抑制细胞凋亡的作用。