背景对于各种肝脏疾病导致的终末期肝衰竭,肝移植是目前医学界公认的最具明确疗效的治疗手段。因目前的供体数量远远不能满足肝移植的需求,如何解决供肝问题,成为当今器官移植领域的研究热点。去细胞化肝脏生物支架(Decellularized Liver Bioscaffold,DLB)是目前在组织工程中提出的一个新观点,通过去细胞化实现对肝脏形态结构的三维重建,保留原来肝脏的绝大部分细胞外基质成分,包括胶原及弹性纤维等。构建一个理想的DLB,解决传统生物支架的低免疫原性、仿生性差及机械强度弱等方面的不足,最终将肝脏细胞及内皮细胞等相关细胞材料与DLB材料实现复合,体外构建适合移植的肝脏,实现对病态肝脏的部分或完全替代,将是组织工程及器官移植领域的一个里程碑。目的本实验结合以往去细胞化器官的制备方案,利用自行设计的去细胞化灌注装置通过化学及酶学相结合的方法制备大鼠DLB,并在支架制备完成后对其进行成分分析,为下一步进行种子细胞再植构建人工肝脏提供实验数据。方法1.成年SD大鼠,雌雄不限,10%水合氯醛腹腔注射麻醉。取腹部纵向切口,上至剑突,下至耻骨联合上缘,仔细分离肝脏与周围组织。于肝下下腔静脉与右肾静脉交汇处,行200U/ml肝素钠溶液全身肝素化处理。显微操作下门静脉置入20G留置针,剪开肝上及肝下下腔静脉,将生理盐水经留置针注入肝脏内,肝脏颜色逐渐变为土黄色时,停止灌注。仔细分离肝脏周围剩余组织,完整取下肝脏。2.将取下的肝脏随机分为对照组与实验组,对照组4%甲醛固定留存,实验组移入去细胞化装置中,首先用配制比例为0.02%胰蛋白酶及0.05%EDTA混合溶液灌注2h,其次用配制比例为4%Triton-X 100及0.05%EDTA混合溶液灌注20-24h,然后用1%SDS溶液灌注2h,再用配制比例为0.1%过氧乙酸及4%乙醇混合溶液灌注2h,最后用头孢唑林钠溶液灌注肝脏6h以上,DLB制备完成。3.对照组与实验组均进行固定,常规行HE染色,透射电镜扫描,同时行I型胶原蛋白、CD35、LCA及Vimentin蛋白免疫组化(immunochistochemistry,IHC)分析。结果1.灌注过程中观察到大鼠肝脏颜色由土黄色逐渐变为半透明,肝脏的脉管系统逐渐显现出来。2.HE染色后,对照组可见大量蓝染并密集分布的细胞核及粉红色分布的细胞外基质,胶原纤维之间无明显断裂。DLB内无明显细胞核成分残留,可观察到呈粉红色并密集分布的细胞外基质。3.透射电镜扫描可见对照组细胞结构明显,清晰看到细胞核卵圆形,高尔基体、内质网等细胞器较丰富,DLB经透射电镜扫描未见明显细胞样结构残存,见大量纤维编织成网状结构,排列有序,同时可见到管状样结构等。4.对照组与DLB内的I型胶原蛋白、CD35、LCA及Vimentin蛋白免疫组化OD值结果进行统计学分析,CD35、LCA及Vimentin蛋白在对照组与DLB内差异有统计学意义,I型胶原蛋白在对照组与DLB内的差异无统计学意义。结论利用化学及酶学灌注法可以构建大鼠DLB,该方案能有效去除肝脏内细胞成分,保留细胞外基质,DLB可用于肝脏组织工程的研究。