白菜型油菜多室基因BrCLV3功能研究

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目前许多研究者通过选育多室角果材料来增加油菜每角果粒数和种子产量,然而有关油菜多室性状的研究主要局限于遗传规律以及结构观察等方面,对于多室基因的克隆以及多室角果形成的调控机理尚无研究报道。在我们前期研究中,通过图位克隆的方法已将白菜型油菜黄籽沙逊中的多室基因ml4精细定位到38.6 kb范围内。在此基础上本研究对其中的多室候选基因BrCL V3进行了功能验证,并初步探讨了多室角果形成的分子机制。主要研究结果如下:  1.对多室突变体和两室野生型的花器官、角果和茎顶端分生组织等结构的变异进行了比较。与野生型相比,突变体的花器官变异主要表现为雄蕊和心皮数目增多;角果多为四室、呈短粗状,大部分角果内着生有额外的雌蕊;在整个发育时期,多室植株的茎顶端分生组织的面积都显著增大,并且这种差异随着植株的发育逐渐增大,表明多室角果的产生可能与茎顶端分生组织的增大有关;不同发育时期的子房切片观察结果表明,角果多室是由早期的多心皮雌蕊发育而来。  2.基因结构分析发现,BrCL V3有3个外显子和2个内含子,共编码94个氨基酸;氨基酸的N端存在一个信号肽,C端存在一个保守的CLE motif;等位基因的比较测序发现Brclv3等位基因是由BrCL V3的一个C/T单核苷酸突变产生的,并且该突变导致CLE motif的第9位脯氨酸突变成了亮氨酸。  3.构建BrCL V3等位基因的超量表达载体和互补表达载体分别转化拟南芥clv3-2突变体和白菜型油菜多室突变体,部分家系的多室角果可以恢复成两室,证实了Brclv3基因即为多室基因;另一方面,构建Brclv3等位基因的超量表达载体转化拟南芥突变体clv3-2和野生型ler,在转基因植株中未发现明显的角果表型变化,表明Brclv3基因不具有拮抗效应。  4.针对CLE motif中的SNP突变合成野生型多肽BrCLV3和突变型多肽BrCLV3Leu9,并对拟南芥和白菜型油菜进行体外处理,结果发现野生型多肽能显著抑制根、根顶端分生组织以及茎顶端分生组织的生长;而突变型多肽丧失了这种抑制作用。该结果进一步证明了Brclv3中第9位脯氨酸突变成亮氨酸可以引起CLV3多肽活性的丧失,最终可能导致了油菜多室角果的产生。  5.以白菜型油菜多室突变体为轮回亲本与和野生型杂交后反复回交,同时结合分子标记辅助选择构建多室/两室性状的近等基因系。在BC4F2代分离群体的初步分析发现,具有Brclv3隐性纯合基因型的单株都为多室表型,并且相对于其它基因型单株,角果长度显著缩短、每角果粒数和千粒重显著增加。该结果表明BrCLV3基因可以在将来的油菜高产育种中具有较大的应用潜力。
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