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组织工程支架材料的设计必须模仿天然细胞外基质的主要结构和功能,论文设计采用能促进细胞特异性黏附的短肽RGD对合成的支架材料进行生物学修饰,通过控制聚合物的组成和结构以调控RGD在材料表面的密度和分布,从而调控细胞在材料表面的行为。本论文的研究对于组织工程支架材料的仿生设计有重要的参考价值。
聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)以及它们的共聚物聚乙/丙交酯(PLGA)是组织工程中常采用的支架材料。天冬氨酸(Asp)是人体必需氨基酸,乙二醇(EG)和聚乙二醇(PEG)均具有良好的亲水性和生物相容性。本论文首先分别以不同分子量的二醇(Diol:乙二醇EG、二缩三乙二醇TEG、三缩四乙二醇BEG以及PEG200,400,600)与天冬氨酸酐缩聚,合成系列两端为羟基的交替预聚物poly(N-Cbz-L-Asp-alt-Diol)。1HNMR和GPC结果显示:Diol链段越短,预聚物的缩聚度越大,导致预聚物分子量和Asp含量增大。以预聚物为大分子引发剂,辛酸亚锡为催化剂引发交酯(LA或LA/GA)开环均聚或共聚,合成了系列含侧氨基的PLGA/PLA-(L-Asp-alt-Diol)x-PLGA/PLA三嵌段共聚物。GPC结果显示除poly(N-Cbz-L-Asp-alt-EG)引发交酯开环聚合所得到的聚合物存在少许均聚物外,其它组分的预聚物引发交酯开环均能得到单分布的三嵌段共聚物。预聚物中Diol链段越短,交酯的转化率越低,但分子量较大,分子量分布较宽;共聚物的玻璃化转变温度(Tg)主要由Diol链段长度和共聚物分子量决定,Diol链段越短以及共聚物分子量越大,共聚物的Tg越高。
在此基础上研究了PLA-(L-Asp-alt-Diol)x-PLA共聚物的组成、预聚物的含量(5,10,15,20wt%)对共聚物分子量、Tg、共聚物中Asp含量、共聚物的亲疏水性、共聚物的体外降解规律和降解机理的影响。结果显示:随着预聚物在共聚物中含量的增加,聚酯链段相对变短,共聚物的分子量和Tg降低,但共聚物的亲水性会明显增强;共聚物中随着Diol链段长度增加和共聚物中预聚物含量降低,Asp的含量从0.90mmol·g-1下降到0.03mmol·g-1。
PLA-(L-Asp-alt-Diol)x-PLA共聚物在pH为7.3的磷酸盐缓冲溶液中(37℃)中降解实验显示:共聚物中PLA链段分子量越大,易于水解的酯键数目增多,初始粘度下降速率越快,质量损失滞后,本体水解特征越明显;共聚物中Diol链段越长(PEG600),预聚物含量越高(20%),共聚物的亲水性越强,质量损失越快,表面蚀解特征明显。根据共聚物在降解过程中组成的变化规律,可以推断出共聚物的降解首先主要发生在聚乳酸链段,随着降解的进行天冬氨酸与Diol之间的酯键和聚乳酸链段与二醇之间的酯键开始断裂。
采用表面接触角仪、XPS和AFM等手段考察了共聚物中Diol的分子量和含量对共聚物膜表面性质如亲水性(表面接触角)、表面化学组成、表面形貌结构等的影响,进一步研究了细胞在不同组成材料表面的黏附和增殖行为。结果发现,以丙酮为溶剂时,共聚物的亲水基团最倾向于膜表面集中,共聚物膜的表面接触角最小,亲水性增强。对于不同组成的聚合物,亲水性随共聚物分子中Diol链段长度增加和预聚物含量的增加而增强。同时,二醇链段越长,共聚物表面的微相分离更为明显。细胞在材料表面的黏附和增殖效率亦随共聚物组成改变而改变,表面N元素含量为1.27%、相分离形成的亲水微区面积约1~2μm的PLA-(L-Asp-alt-BEG)x-PLA共聚物最有利于细胞的黏附和增殖。
最后,将PLA-(L-Asp-alt-Diol)x-PLA中侧氨基转化为侧羧基,进一步活化侧羧基,将活化后的共聚物在水介质中自组装形成胶束,使得功能基团暴露在胶束表面并与RGD分子键合,采用1HNMR确证了其结构。通过在含有不同RGD密度和分布的仿生材料表面复合犬骨髓基质干细胞,检测细胞的黏附和增殖行为,发现键合RGD活性分子之后的仿生材料相对键合之前能有效地促进细胞黏附和增殖。在键合有RGD的PLA-(L-Asp-alt-Diol)x-PLA三种仿生材料中,键合有RGD的PLA-(L-Asp-alt-BEG)x-PLA的仿生材料的细胞黏附率可高达91.5%,对细胞黏附和增殖的促进效果均优于另外两种。而对于同种仿生材料,键合RGD密度越大,对细胞的黏附和增殖促进效果越好。该实验结果为进一步在三维支架上对材料表面固定RGD促进细胞黏附等行为提供了科学依据。